聚γ-谷氨酸是一种多功能的生物可降解聚合物,在医药、农业、食品、环保和轻化工等领域具有广泛应用价值。目前,聚γ-谷氨酸的商业化生产主要依赖于微生物发酵法,但是由于需要添加聚γ-谷氨酸合成前体物和发酵副产物过多导致葡萄糖向聚γ-谷氨酸的转化偏低。本研究拟通过地衣芽胞杆菌的中心碳代谢改造、辅酶平衡改造及能量供给来降低副产物合成,从而提高葡萄糖向聚γ-谷氨酸的转化能力。C4化合物草酰乙酸在三羧酸衍生氨基酸合成代谢中起着主导作用,其能够影响细胞生长,且草酰乙酸胞内积累量也影响着三羧酸循环的运转速度。本研究首先以地衣芽胞杆菌WX-02为出发菌株,通过外源表达大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因pp C和强化表达地衣芽胞杆菌丙酮酸羧化酶基因pyc A来验证C4回补途径强化对聚γ-谷氨酸合成的影响。结果发现,外源表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因pp C和游离表达丙酮酸羧化酶基因pyc A使聚γ-谷氨酸产量分别提高了33.82%和65.59%。乙醛酸循环是TCA循环的一个重要分支。异柠檬酸在异柠檬酸裂解酶的作用下生成乙醛酸;乙醛酸又会形成琥珀酸和苹果酸。为了保证代谢通量由草酰乙酸到柠檬酸、再到α-酮戊二酸流向谷氨酸,减少代谢通量进入乙醛酸循环回流,本研究在WX-02的基础上,通过缺失异柠檬酸裂解酶基因ace A进而阻断了乙醛酸循环。随后采用强启动子PRBS6分别替换了WX-02△ace A中丙酮酸羧化酶基因pyc A、柠檬酸合成酶基因cit Z、琥珀酸脱氢酶基因sdh B启动子替换菌株来增强TCA循环的运转,所得工程菌依次命名WX-02△ace A-RBS6-pyc A、WX-02△ace A-RBS6-cit Z、WX-02△ace A-RBS6-sdh B,所得工程菌相比于对照菌株聚γ-谷氨酸产量分别提高了57.91%,61.28%,20.03%,并且相应菌株中发酵终点的副产物乙偶姻、2,3-丁二醇及乙酸总量也有不同程度的降低,但是副产物积累的总量依旧偏高。乙偶姻和2,3-丁二醇作为聚γ-谷氨酸发酵过程中的主要副产物,两者合成会消耗大量NADH。本研究通过缺失乙酰乳酸脱羧酶基因als D阻断了两者的合成,但是als D的缺失会出现酸化现象和辅酶失衡等问题,进而显著降低了菌株的生长能力,从而影响聚γ-谷氨酸合成。另外,WX-02中谷氨酸脱氢酶是利用NADPH作为辅因子来合成谷氨酸。我们首先对来自地衣芽胞杆菌WX-02、谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032、枯草芽胞杆菌168和大肠杆菌BL21中的谷氨酸脱氢酶进行筛选,结果发现地衣芽胞杆菌WX-02中的谷氨酸脱氢酶基因roc G的强化表达在聚γ-谷氨酸的产量方面效果最好。本研究利用定点突变技术改造谷氨酸脱氢酶,使其辅酶特异性由NADPH转变成NADH。随后将突变的谷氨酸脱氢酶在WX-02△als D中进行表达,发现有两株工程菌的生长和聚γ-谷氨酸合成能力得到显著改善。其中roc G2号突变体菌株的突变位点为276位的天冬氨酸突变为谷氨酸和277位的丝氨酸突变为色氨酸,该菌株聚γ-谷氨酸产量提高了101.82%,生物量提高了71.04%。提高ATP供应水平是微生物发酵促目的产物高产有效的手段。氧化磷酸化是有氧条件下主要的供能途径,本研究验证了电子传递链通路基因的游离强化表达能促进聚γ-谷氨酸的合成;同时,我们利用Tat型信号肽将透明颤菌血红蛋白VHb分别定位于细胞周质空间和细胞壁进行表达。结果发现,定位于细胞周质空间的VHb表达效果优于细胞壁的VHb,细胞周质空间的VHb表达菌株的聚γ-谷氨酸产量提高了26.13%,对数生长期ATP浓度提高了76.37%。本研究最后构建了一株叠加工程菌株WX-02△ace ARBS6-cit Z-pyc A/300-roc G2,其聚γ-谷氨酸产量为18.32 g/L,相比于出发菌株WX-02产量提高了2.41倍。综上所述,由丙酮酸羧化成草酰乙酸的反应可能作为WX-02合成聚γ-谷氨酸的第一个代谢瓶颈;增加TCA循环的代谢通量强化了胞内谷氨酸的合成,同时减少副产物生产且合理利用辅酶工程可以增强地衣芽胞杆菌利用葡萄糖合成聚γ-谷氨酸的能力。