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第一部分PLCε特异性shRNA真核表达载体的构建和鉴定目的:构建人源PLCε基因编码区的短发夹状shRNA真核表达质粒载体。方法:1.设计合成针对PLCε基因的shRNA与具有荧光蛋白表达的pGenesil-1质粒连接,构建的重组质粒分别命名为阳性质粒pGenesil-PLCε1、pGenesil-PLCε2和阴性质粒pGenesil-NP;2.重组质粒体外转染T24、BIU-87细胞后用荧光显微镜观察重组质粒的绿色荧光强度,判断最佳转染时间及质粒与脂质体比例;3.用RT-PCR和Westernblot检测转染重组质粒前后T24、BIU-87细胞PLCε的表达变化。结果:1.经凝胶电泳、DNA测序分析,成功构建PLCε特异性shRNA重组质粒pGenesil-PLCε1、pGenesil-PLCε2及pGenesil-NP;2.用荧光显微镜观察发现重组质粒转染48h,质粒与脂质体比例为1:2时细胞荧光强度最强;3.RT-PCR和Westernblot显示阳性质粒pGenesil-PLCε1、pGenesil-PLCε2转染成功后可明显下调膀胱癌细胞PLCεmRNA和蛋白表达水平(p<0.01)。结论:构建的重组质粒pGenesil-PLCε1、pGenesil-PLCε2转染能有效抑制人膀胱癌细胞株T24、BIU-87PLCε基因的表达。第二部分PLCεshRNA重组质粒诱导膀胱肿瘤细胞凋亡的实验研究目的:进一步探讨转染重组质粒对诱导膀胱癌细胞株凋亡的影响。方法:1.流式细胞术检测细胞周期变化和细胞凋亡;2.RT-PCR检测Bcl-2、Bax mRNA表达;3.原位杂交检测NF-κB P50 mRNA表达;4.电镜观察细胞形态改变。结果:1.流式细胞术显示阳性质粒转染组的细胞周期呈明显G0/G1期阻滞(p<0.05),并出现凋亡峰,细胞凋亡率增加(p<0.05);2.RT-PCR显示阳性质粒转染组细胞Bcl-2 mRNA表达水平下降(p<0.05),Bax mRNA表达水平上调(p<0.05);3.原位杂交显示阳性质粒转染组细胞NF-κB P50 mRNA表达下调(p<0.05);4.电镜观察阳性质粒转染组细胞可见凋亡小体。结论:构建的重组质粒pGenesil-PLCε1、pGenesil-PLCε2转染人膀胱癌细胞株T24、BIU-87可诱导细胞凋亡,推测转染外源性PLCεshRNA基因能下调PLCε基因的表达从而促进膀胱癌细胞的凋亡,与细胞周期分布的改变有关,作用的分子机制与下调Bcl-2、NF-κB和上调Bax的基因表达有关。PLCε可能是NF-κB信号通路的上游调节因子之一。