论文部分内容阅读
目的：
建立透镜诱导近视（lens-induced myopia,LIM）豚鼠动物模型，分析睫状肌组织在近视发生发展过程中的病理变化，探讨电针刺激双侧太阳穴、合谷穴延缓LIM豚鼠近视发展的分子机制，为临床电针治疗近视提供理论基础。
方法：
实验包括三部分。第一部分：电针在透镜诱导近视豚鼠睫状肌中表皮生长因子及其受体表达中的作用。72只2周龄健康三色短毛豚鼠随机平均分为正常对照（normal control,NC）组、透镜诱导近视（lens-induced myopia,LIM）组、透镜诱导近视电针（lens-induced myopia+electroacupuncture,LIM+EA）组和透镜诱导近视电针假穴（Sham）组,每组根据造模时间分为2周、4周两个时间点，每组每个时间点9只豚鼠。NC组豚鼠正常饲养，LIM组、LIM+EA组和Sham组豚鼠右眼均戴-6D透镜诱导近视，左眼不戴镜作为自身对照；LIM+EA组豚鼠在戴镜同时给予电针刺激双侧太阳穴、合谷穴，Sham组豚鼠右眼戴镜的同时，给予电针刺激臀部。分别在入组前和近视诱导/电针干预处理后2周、4周各时间点对各组豚鼠进行屈光度和眼轴长度的检测。各组分别于造模后2周、4周将豚鼠麻醉处死后摘取右眼眼球：制作组织病理切片观察睫状肌的形态，通过定量聚合酶链反应（quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR）和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）分别检测各组豚鼠睫状肌中表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）mRNA及蛋白表达水平的变化。
第二部分：电针对透镜诱导近视豚鼠睫状肌组织钾离子稳态的影响。132只豚鼠随机平均分为四组，每组根据造模时间分为2周（n=15）、4周（n=18）两个时间点，其余同第一部分。分别在入组前和近视诱导/电针干预处理后2周、4周各时间点对各组豚鼠进行屈光度和眼轴长度的检测。每组分别于造模后2周、4周将豚鼠麻醉处死后摘取右眼眼球：检测睫状肌中三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）和乳酸（lactic acid,LA）的含量，测定睫状肌组织中Na+/K+-ATPase的表达及活性，并监测造模后4周各组豚鼠睫状肌组织中钾离子（potassium ion,K+）流速的变化。
第三部分：透镜诱导近视豚鼠睫状肌的转录组学分析。27只豚鼠随机平均分为三组，包括NC组、LIM组和LIM+EA组，其余同第一部分，各组造模时间为2周。分别在入组前和近视诱导/电针干预处理后2周，对各组豚鼠进行屈光度和眼轴长度的检测。造模后2周将豚鼠麻醉处死后摘取右眼眼球，每组随机选取3只豚鼠右眼睫状肌组织进行转录组基因测序，并对各组间差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）进行基因本体（Gene Ontology,GO）生物学过程和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）分析，每组剩余豚鼠睫状肌组织用作LIM组DEGs参与的KEGG分析中显著富集的补体和凝血级联途径显著上调表达的豚鼠补体因子H（CFH）、豚鼠补体因子I（CFI）及豚鼠补体C4的验证，分析电针对LIM豚鼠睫状肌CFH、CFI及C4表达变化的影响。
结果：
造模后2周、4周，各组近视造模眼分别与自身对照眼及与NC组右眼相比近视屈光度增加、眼轴延长，且近视程度随造模时间的延长而加深；与LIM组造模眼相比，LIM+EA组造模眼近视屈光度减小、眼轴延长减缓，差异均有统计学意义；Sham组与LIM组造模眼相比，屈光度和眼轴差异无统计学意义。病理结果显示，NC组豚鼠睫状肌纤维完整、排列有序，LIM组和Sham组睫状肌纤维断裂、溶解、排列混乱，而LIM+EA组睫状肌纤维相对完整，排列有序。与NC组相比，LIM组豚鼠睫状肌中EGF和EGFR表达、ATP含量和Na+/K+-ATPase表达及活性均明显降低，LA含量明显升高，而LIM+EA组与NC组相比，差异无统计学意义；与LIM组相比，LIM+EA组豚鼠睫状肌中EGF和EGFR表达、ATP含量和Na+/K+-ATPase表达及活性均明显升高，LA含量明显降低，而Sham组与LIM组相比，差异无统计学意义。造模后4周，NC组和LIM+EA组豚鼠睫状肌中K+流速表现为围绕基线附近波动，且流速值较小；LIM组和Sham组豚鼠睫状肌中K+流速表现为向细胞内流动，呈现吸收状态，且流速值较大。造模后2周，与NC组相比，LIM组豚鼠睫状肌中有404个DEGs，其中包括131个上调基因和273个下调基因；与LIM组比较，LIM+EA组豚鼠睫状肌中有10个DEGs，包括7个上调基因和3个下调基因。各组DEGs的GO富集分析主要集中在生物过程中的细胞、生物调节、代谢及免疫系统等方面。进一步分析发现，LIM组DEGs有9条显著富集到的KEGG通路，主要包括金黄色葡萄球菌感染、补体和凝血级联途径、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。对LIM组DEGs富集到的KEGG通路补体和凝血级联途径中上调表达的分子CFH、CFI、C4进行验证发现：与NC组相比，LIM组CFH、CFI、C4这三种分子蛋白表达显著上调，与转录组学分析结果一致；与LIM相比，LIM+EA组CFH、CFI、C4这三种分子蛋白表达显著下调，且LIM+EA组与NC组相比，差异无统计学意义。
结论：
近视豚鼠可发生睫状肌形态破坏、能量代谢障碍及免疫功能紊乱进而导致K+平衡紊乱。电针刺激近视豚鼠双侧太阳穴、合谷穴可通过提高Na+/K+-ATPase表达和活性维持K+稳态，从而提高睫状肌的生理功能和调节功能，延缓近视发展。此外，电针刺激双侧太阳穴、合谷穴可降低近视豚鼠睫状肌组织中相关补体因子的表达。
建立透镜诱导近视（lens-induced myopia,LIM）豚鼠动物模型，分析睫状肌组织在近视发生发展过程中的病理变化，探讨电针刺激双侧太阳穴、合谷穴延缓LIM豚鼠近视发展的分子机制，为临床电针治疗近视提供理论基础。
方法：
实验包括三部分。第一部分：电针在透镜诱导近视豚鼠睫状肌中表皮生长因子及其受体表达中的作用。72只2周龄健康三色短毛豚鼠随机平均分为正常对照（normal control,NC）组、透镜诱导近视（lens-induced myopia,LIM）组、透镜诱导近视电针（lens-induced myopia+electroacupuncture,LIM+EA）组和透镜诱导近视电针假穴（Sham）组,每组根据造模时间分为2周、4周两个时间点，每组每个时间点9只豚鼠。NC组豚鼠正常饲养，LIM组、LIM+EA组和Sham组豚鼠右眼均戴-6D透镜诱导近视，左眼不戴镜作为自身对照；LIM+EA组豚鼠在戴镜同时给予电针刺激双侧太阳穴、合谷穴，Sham组豚鼠右眼戴镜的同时，给予电针刺激臀部。分别在入组前和近视诱导/电针干预处理后2周、4周各时间点对各组豚鼠进行屈光度和眼轴长度的检测。各组分别于造模后2周、4周将豚鼠麻醉处死后摘取右眼眼球：制作组织病理切片观察睫状肌的形态，通过定量聚合酶链反应（quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR）和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）分别检测各组豚鼠睫状肌中表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）mRNA及蛋白表达水平的变化。
第二部分：电针对透镜诱导近视豚鼠睫状肌组织钾离子稳态的影响。132只豚鼠随机平均分为四组，每组根据造模时间分为2周（n=15）、4周（n=18）两个时间点，其余同第一部分。分别在入组前和近视诱导/电针干预处理后2周、4周各时间点对各组豚鼠进行屈光度和眼轴长度的检测。每组分别于造模后2周、4周将豚鼠麻醉处死后摘取右眼眼球：检测睫状肌中三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）和乳酸（lactic acid,LA）的含量，测定睫状肌组织中Na+/K+-ATPase的表达及活性，并监测造模后4周各组豚鼠睫状肌组织中钾离子（potassium ion,K+）流速的变化。
第三部分：透镜诱导近视豚鼠睫状肌的转录组学分析。27只豚鼠随机平均分为三组，包括NC组、LIM组和LIM+EA组，其余同第一部分，各组造模时间为2周。分别在入组前和近视诱导/电针干预处理后2周，对各组豚鼠进行屈光度和眼轴长度的检测。造模后2周将豚鼠麻醉处死后摘取右眼眼球，每组随机选取3只豚鼠右眼睫状肌组织进行转录组基因测序，并对各组间差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）进行基因本体（Gene Ontology,GO）生物学过程和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）分析，每组剩余豚鼠睫状肌组织用作LIM组DEGs参与的KEGG分析中显著富集的补体和凝血级联途径显著上调表达的豚鼠补体因子H（CFH）、豚鼠补体因子I（CFI）及豚鼠补体C4的验证，分析电针对LIM豚鼠睫状肌CFH、CFI及C4表达变化的影响。
结果：
造模后2周、4周，各组近视造模眼分别与自身对照眼及与NC组右眼相比近视屈光度增加、眼轴延长，且近视程度随造模时间的延长而加深；与LIM组造模眼相比，LIM+EA组造模眼近视屈光度减小、眼轴延长减缓，差异均有统计学意义；Sham组与LIM组造模眼相比，屈光度和眼轴差异无统计学意义。病理结果显示，NC组豚鼠睫状肌纤维完整、排列有序，LIM组和Sham组睫状肌纤维断裂、溶解、排列混乱，而LIM+EA组睫状肌纤维相对完整，排列有序。与NC组相比，LIM组豚鼠睫状肌中EGF和EGFR表达、ATP含量和Na+/K+-ATPase表达及活性均明显降低，LA含量明显升高，而LIM+EA组与NC组相比，差异无统计学意义；与LIM组相比，LIM+EA组豚鼠睫状肌中EGF和EGFR表达、ATP含量和Na+/K+-ATPase表达及活性均明显升高，LA含量明显降低，而Sham组与LIM组相比，差异无统计学意义。造模后4周，NC组和LIM+EA组豚鼠睫状肌中K+流速表现为围绕基线附近波动，且流速值较小；LIM组和Sham组豚鼠睫状肌中K+流速表现为向细胞内流动，呈现吸收状态，且流速值较大。造模后2周，与NC组相比，LIM组豚鼠睫状肌中有404个DEGs，其中包括131个上调基因和273个下调基因；与LIM组比较，LIM+EA组豚鼠睫状肌中有10个DEGs，包括7个上调基因和3个下调基因。各组DEGs的GO富集分析主要集中在生物过程中的细胞、生物调节、代谢及免疫系统等方面。进一步分析发现，LIM组DEGs有9条显著富集到的KEGG通路，主要包括金黄色葡萄球菌感染、补体和凝血级联途径、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。对LIM组DEGs富集到的KEGG通路补体和凝血级联途径中上调表达的分子CFH、CFI、C4进行验证发现：与NC组相比，LIM组CFH、CFI、C4这三种分子蛋白表达显著上调，与转录组学分析结果一致；与LIM相比，LIM+EA组CFH、CFI、C4这三种分子蛋白表达显著下调，且LIM+EA组与NC组相比，差异无统计学意义。
结论：
近视豚鼠可发生睫状肌形态破坏、能量代谢障碍及免疫功能紊乱进而导致K+平衡紊乱。电针刺激近视豚鼠双侧太阳穴、合谷穴可通过提高Na+/K+-ATPase表达和活性维持K+稳态，从而提高睫状肌的生理功能和调节功能，延缓近视发展。此外，电针刺激双侧太阳穴、合谷穴可降低近视豚鼠睫状肌组织中相关补体因子的表达。