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PD-1（programmed death1, PD-1）最初是从T细胞中克隆出来的，是CD28家族的一个成员，主要在活化的T细胞、B细胞和单核细胞上表达，有PD-L1和PD-L2两个配体。PD-1及其配体相互作用致使效性T细胞的功能抑制，在阻断PD-1/PD-L1通路后，可使功能耗竭的T细胞功能恢复。有研究表明，PD-1的表达量与疾病的进程有关，且在阻断PD-1/PD-L1通路后可治疗持续性病毒感染。但是，由于缺乏原材料，在猪病中对PD-1/PD-L1通路的研究较少。本研究以猪PD-1及PD-L1为研究对象，通过克隆、原核表达获得正确表达的PD-1及PD-L1胞外区蛋白，为研究PD-1/PD-L1通路在猪病的作用提供原材料。本研究根据GenBank中猪PD-1和PD-L1的基因序列及原核表达载体多克隆酶切位点，设计其胞外区引物，以猪外周血单个核细胞（PBMC）的cDNA为模板，应用PCR技术扩增PD-1、PD-L1胞外区片段，并与pMD18-T-simple载体连接，构建pMD-PD1、pMD-PDL1重组质粒，转化至DH5α中通过菌液PCR筛选阳性克隆并测序，利用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分别对阳性重组质粒pMD-PD1、pMD-PDL1及原核表达载体pET-32a(+)进行双酶切并回收，利用T4DNA连接酶连接回收的酶切目的片段及载体片段，构建pET-32a-PD1和pET-32a-PDL1原核表达载体，连接产物转化至DH5α中，经鉴定正确后转化至宿主菌Rosetta（DE3）进行诱导表达。应用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况，Western-blot鉴定重组蛋白的抗原特异性。然后采用镍柱对重组目的蛋白进行分离纯化，并制备多抗血清。以两种胞外区重组蛋白免疫后获得的具有免疫学活性的多抗血清为一抗，检测猪PBMC细胞表面PD-1及PD-L1对两种多抗血清的结合效果，以验证所获PD-1及PD-L1胞外区重组蛋白是具有生物学活性。实验结果表明，成功扩增出366bp的PD-1和684bp的PD-L1胞外区基因，测序结果表明，所获得的两个目的片段均未发生氨基酸的突变。成功构建的pET-32a-PD1和pET-32a-PDL1原核重组表达载体并进行诱导表达，SDS-PAGE分析结果显示，分别获得了33kDa和45kDa的两条目的蛋白条带，且两种重组蛋白均以包涵体形式存在。Western-blot鉴定结果显示，PD-1及PD-L1胞外区重组目的蛋白均能与载体特异性标签His单抗反应，同时PD-1还可以与抗人PD-1单抗反应，表明两种胞外区蛋白均成功诱导表达。PD-1和PD-L1胞外区重组蛋白经镍柱纯化后，浓度分别为0.9mg/mL和1.5mg/mL。免疫家兔制备兔抗猪PD-1及PD-L1多抗血清，利用流式细胞术检测获得的多抗与PBMC上PD-1和PD-L1的反应性，结果显示获得的多抗能与PBMC上的PD-1和PD-L1蛋白发生反应。通过以上结果初步证明，本研究通过原核表达并纯化获得的PD-1及PD-L1胞外区重组蛋白，具有生物学活性，可用于制备其相应的单克隆抗体或者作为可溶性分子用于阻断PD-1/PD-L1信号通路，研究其在猪免疫抑制病中的功能及作用。