论文部分内容阅读
目的:变应性鼻炎（AR）系指易感个体接触变应原后由IgE（immunoglobulin E,IgE）介导的炎性介质释放,并伴有多种免疫活性细胞和细胞因子等共同参与的鼻黏膜慢性炎症反应性疾病[1-4]。对于变应性鼻炎的产生机制的深入理解对于预防并彻底根治本疾病具有重要的意义。据文献记载,经过体外培养后形成的过敏状态的腭扁桃体会差异化表达IgE+B淋巴细胞[5]。但是在变应性鼻炎患者的腭扁桃体中,是否仍然会有与体外培养相同的高度差异化表达IgE+B淋巴细胞的结果呢?而相对应的非变应性鼻炎患者的腭扁桃体中IgE+B淋巴细胞的差异化表达情况又是如何呢?均未曾得到确认。在变应性鼻炎患者的腭扁桃体中,B淋巴细胞的各种亚型:浆细胞、生发中心B细胞、记忆B细胞、幼稚B细胞又会与正常受试者相比出现什么样的改变呢,而它们与IgE+B淋巴细胞的关系又是如何呢,将是我们的实验分析的重要方向。研究方法:1、样本来源收集2016年6月至2017年9月于我院耳鼻喉科住院实施腭扁桃体切除术并临床诊断为变应性鼻炎且吸入物过敏原至少一项阳性患者的腭扁桃体样本,共26例,其中男性16例,女性10例,年龄为6岁51岁,平均年龄为26.27岁,同时排除其他自身免疫性疾病、血液病、肿瘤、肝肾疾病以及急、慢性感染等病史。同时选取15例非变应性鼻炎且吸入物过敏原全部阴性患者的腭扁桃体组织,其中男性11例,女性4例,年龄为6岁54岁,平均年龄为26.13岁。2、试剂过敏原特异性IgE抗体检测试纸条（苏州浩欧博生物医药有限公司）酶标抗体结合液（苏州浩欧博生物医药有限公司）牛碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体溶液（苏州浩欧博生物医药有限公司）FITC标记的鼠抗人IgE多克隆抗体（美国BD Pharmingen）PerCP标记的鼠抗人CD19多克隆抗体（美国BD Pharmingen）PE标记的鼠抗人CD27多克隆抗体（美国BD Pharmingen）FITC标记的鼠抗人CD38多克隆抗体购自美国BD Pharmingen)人外周血淋巴细胞分离液（天津市灝洋生物科技有限公司）PBS液（实验室自配）3、临床资料收集搜集5ml患者静脉血,用作过敏原特异性IgE抗体检测。收集纳入研究患者的年龄与性别资料。疾病诊断方法根据中华耳鼻咽喉头颈外科兰州标准进行诊断。[11]4、静脉血过敏原特异性IgE抗体检测对每个患者的血清样本,准备3个反应用试管。吸取样本加入到第一个试管的突起的刻度线的位置,然后放入ELISA测试条,包裹试管后,室温孵育6小时或过夜处理。随后取出测试条,在自来水水流的下端冲洗55秒。水流要有一定的冲力,且保持冲力恒定。在水流中前后移动测试条,保证检测区域都得到充分的清洗。在第二个试管内加入酶标抗体结合液至突起的刻度线的位置,将冲洗完的测试条放入反应管中,包裹试管后,室温孵育30分钟。取出测试条,在自来水水流的下端冲洗至红色完全消失。在水流中前后移动测试条,保证检测区域都得到充分清洗。在第三个反应管内加入底物液至突起的刻度线位置,将冲洗完的测试条放入试管中,包裹试管后,室温孵育30分钟。将测试条从反应管中取出,用吸水纸蘸干。在室温下干燥处理,至少放置30分钟后,进行结果的判读。5、流式细胞术抗体染色腭扁桃体样本经过洗涤剪切后研磨成匀浆,离心洗涤重悬后经过密度梯度离心法（Ficoll法）提取出单核细胞,分离出的单核细胞调整好细胞数后置于离心管中,取细胞悬液100ul加入流式管,加入IgE、CD19抗体各1ul,吹打混匀后,流式管放入试管架中用锡纸包好,放入4°C冰箱中反应30min。另一流式管中加入CD27,、CD38抗体做表面染色。用来确定浆细胞的差异化表达以及B淋巴细胞亚型的差异化表达。6、数据处理采用SPSS 20.0统计软件分析处理数据。各项检测数据以?x±s表示,两独立样本均数比较采用配对样本t检验,两变量相关性分析采用Spearman相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1、10种过敏原的吸入物过敏原结果在26例临床诊断为变应性鼻炎的患者中,经过10项过敏原特异性IgE抗体检测后,变应原阳性率由高到低的顺序为:尘螨15例,猫毛10例,狗上皮10例,艾蒿6例,霉菌5例,葎草4例,其它4例,同一患者最多对4种变应原呈阳性反应,提示临床上对单一的过敏原进行脱敏治疗可能受到的疗效欠佳。2、变应性鼻炎组腭扁桃体中IgE+B淋巴细胞的差异化表达在变应性鼻炎组中,我们发现IgE+B淋巴细胞的差异化表达明显高于其在非变应性鼻炎组中的差异化表达。3、变应性鼻炎组腭扁桃体中各B淋巴细胞亚型表达与非变应性鼻炎组中的差异变应性鼻炎组腭扁桃体中,生发中心B细胞及浆细胞表达的百分比明显升高。4、变应性鼻炎组腭扁桃体中生发中心B细胞与IgE+B淋巴细胞表达的关系变应性鼻炎组中IgE+B淋巴细胞的表达量与生发中心B细胞百分比呈正相关。结论:1、10种过敏原引起的变应性鼻炎组腭扁桃体中IgE+B淋巴细胞的差异化表达高于非变应性鼻炎组,与变应性鼻炎血中特异性IgE的增高结果一致。2、变应性鼻炎组中生发中心B细胞及浆细胞百分比升高。体现了生发中心B淋巴细胞的向IgE+B淋巴细胞的转化能力。同时浆细胞作为分泌IgE的效应细胞,在浆细胞增高的同时,IgE+B淋巴细胞的表达也会增加。3、变应性鼻炎组患者的B淋巴细胞亚群中,生发中心B细胞百分比与IgE+B淋巴细胞呈正相关,提示在变应性鼻炎中生发中心B细胞的“固有属性”会使IgE+B淋巴细胞增多。