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【背景】：
膜联蛋白A1（Annexin A1，ANXA1）是Ca2+依赖性磷脂结合蛋白膜联蛋白家族中的一员，分布于身体的各个组织和器官中，参与调控细胞内多种生物过程。ANXA1最早在中枢及外周炎症，免疫修复和内分泌调控等方面被广泛研究，近年来其在癌症和神经系统疾病等重大疾病领域的调节功能也逐渐被阐明，这些功能很多与其结构变化和亚细胞定位相关。ANXA1在胞浆、胞核中广泛分布，部分通过N-末端结构域发挥作用连接于细胞膜上，这些不同的亚细胞定位决定了ANXA1不同状态下的生理作用。当胞浆中ANXA1的总量不变时，ANXA1的上膜过程和入核过程处于一种此消彼长的竞争状态，对神经元细胞而言，ANXA1的上膜过程起到保护作用，而其入核过程则是一种损伤作用。ANXA1的磷酸化修饰能影响其亚细胞定位，ANXA1 在第 5位或27位丝氨酸磷酸化后可促进其入核从而进一步加重缺血缺氧状态下的脑损伤。
蛋白质磷酸化修饰与苏木化修饰间通常会发生对抗或者协同的复杂相互作用， ANXA1苏木化可能影响磷酸化修饰状态从而影响其亚细胞定位。小泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-like modifier，SUMO）是一类存在于多数真核细胞中的分子量约为11 KDa的小泛素类蛋白，SUMO化与泛素化修饰类似，是以三步级联机制进行的动态可逆的酶促过程，需要E1活化酶（Aos1/Uba2），E2结合酶（Ubc9）和E3连接酶的连续作用，而去SUMO化酶（SENP家族）可以去除SUMO化修饰使其恢复初始待活化状态。SUMO 化修饰酶中 E3 连接酶的种类最多，主要有 SP-RING（Siz / Pias）家族以及RanBP2和ZNF451家族，不同蛋白质的SUMO化过程中参与的E3酶类型及活性各有差异。SUMO化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，已经在多种模拟神经损伤所致的细胞应激实验中被证实是内源性神经保护策略，但在神经系统疾病研究领域，SUMO化作为ANXA1的另一种蛋白质翻译后修饰方式，参与此过程的修饰酶类型以及具体的SUMO化位点还有待研究。
【目的】：
探索ANXA1 SUMO化修饰过程所涉及到的SUMO蛋白和修饰酶类型以及具体的SUMO化修饰位点，以作为后期深度研究的基础。
【方法】：
本课题除在原代培养小胶质细胞上进行 SUMO 化相关基因表达谱的筛选外主要以经典的转染率较高的模式细胞系HEK293（人胚胎肾上皮细胞）细胞系为研究对象：
（1）利用实时荧光定量qPCR技术检测原代培养的小胶质细胞中SUMO化相关基因的mRNA表达水平；
（2）利用质粒构建技术构建本课题所需的质粒，利用定点突变技术构建ANXA1各类型点突变质粒；
（3）利用SUMOplotTM软件预测出ANXA1可能的SUMO化修饰位点；
（4）利用Ni2+-NTA亲和层析技术测定外源或内源性 SUMO化的 ANXA1，用免疫印迹实验（Western blot）检测特定处理下特定分子的蛋白表达结果；
（5）利用免疫共沉淀技术(Co-IP)检测中特定处理下指定的两种蛋白质的结合情况。
【结果】：
（1）原代培养的小胶质细胞经OGD/R处理后SUMO2和Ubc9的 mRNA表达水平显著升高。
（2） SUMO2 是 ANXA1 SUMO 化的主要 SUMO 蛋白；外源性 ANXA1 和SUMO2有实际结合，内源性的ANXA1也能被SUMO2所SUMO化，因此在后期的ANXA1的SUMO化修饰研究中我们以SUMO2为主要的SUMO蛋白研究对象；
（3）上调Ubc9可以促进ANXA1的SUMO化修饰，上调Ubc9后ANXA1与Ubc9的结合增多，在ANXA1的SUMO化修饰中，Ubc9发挥着十分重要的作用；
（4）过表达PIAS3对ANXA1的SUMO化相比于其他类型的E3酶有更好的促进效果，外源性ANXA1与PIAS3确实有实际结合；
（5）第113位，第161位和第257位赖氨酸是ANXA1发生 SUMO化的主要位点，干预其中任意一个／两个／三个位点都会明显降低甚至阻断ANXA1的SUMO化，同时突变这三个位点后ANXA1与SUMO2的结合完全消失；上调Ubc9或者PIAS3水平均能促进ANXA1 SUMO化，突变掉ANXA1 SUMO化位点（ANXA1-3KR ）后不论是在正常生理状态还是上调Ubc9或者PIAS3水平，ANXA1均不发生SUMO化。
【结论】：
本研究证实了在HEK293细胞中，ANXA1 SUMO化相关的主要SUMO蛋白是SUMO2，上调E2连接酶Ubc9能够促进ANXA1 SUMO化，ANXA1 SUMO化中促进作用效果最佳的E3酶是PIAS3，ANXA1与SUMO2作用发生SUMO化的主要位点是第第113位，第161位和第257位赖氨酸。
膜联蛋白A1（Annexin A1，ANXA1）是Ca2+依赖性磷脂结合蛋白膜联蛋白家族中的一员，分布于身体的各个组织和器官中，参与调控细胞内多种生物过程。ANXA1最早在中枢及外周炎症，免疫修复和内分泌调控等方面被广泛研究，近年来其在癌症和神经系统疾病等重大疾病领域的调节功能也逐渐被阐明，这些功能很多与其结构变化和亚细胞定位相关。ANXA1在胞浆、胞核中广泛分布，部分通过N-末端结构域发挥作用连接于细胞膜上，这些不同的亚细胞定位决定了ANXA1不同状态下的生理作用。当胞浆中ANXA1的总量不变时，ANXA1的上膜过程和入核过程处于一种此消彼长的竞争状态，对神经元细胞而言，ANXA1的上膜过程起到保护作用，而其入核过程则是一种损伤作用。ANXA1的磷酸化修饰能影响其亚细胞定位，ANXA1 在第 5位或27位丝氨酸磷酸化后可促进其入核从而进一步加重缺血缺氧状态下的脑损伤。
蛋白质磷酸化修饰与苏木化修饰间通常会发生对抗或者协同的复杂相互作用， ANXA1苏木化可能影响磷酸化修饰状态从而影响其亚细胞定位。小泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-like modifier，SUMO）是一类存在于多数真核细胞中的分子量约为11 KDa的小泛素类蛋白，SUMO化与泛素化修饰类似，是以三步级联机制进行的动态可逆的酶促过程，需要E1活化酶（Aos1/Uba2），E2结合酶（Ubc9）和E3连接酶的连续作用，而去SUMO化酶（SENP家族）可以去除SUMO化修饰使其恢复初始待活化状态。SUMO 化修饰酶中 E3 连接酶的种类最多，主要有 SP-RING（Siz / Pias）家族以及RanBP2和ZNF451家族，不同蛋白质的SUMO化过程中参与的E3酶类型及活性各有差异。SUMO化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，已经在多种模拟神经损伤所致的细胞应激实验中被证实是内源性神经保护策略，但在神经系统疾病研究领域，SUMO化作为ANXA1的另一种蛋白质翻译后修饰方式，参与此过程的修饰酶类型以及具体的SUMO化位点还有待研究。
【目的】：
探索ANXA1 SUMO化修饰过程所涉及到的SUMO蛋白和修饰酶类型以及具体的SUMO化修饰位点，以作为后期深度研究的基础。
【方法】：
本课题除在原代培养小胶质细胞上进行 SUMO 化相关基因表达谱的筛选外主要以经典的转染率较高的模式细胞系HEK293（人胚胎肾上皮细胞）细胞系为研究对象：
（1）利用实时荧光定量qPCR技术检测原代培养的小胶质细胞中SUMO化相关基因的mRNA表达水平；
（2）利用质粒构建技术构建本课题所需的质粒，利用定点突变技术构建ANXA1各类型点突变质粒；
（3）利用SUMOplotTM软件预测出ANXA1可能的SUMO化修饰位点；
（4）利用Ni2+-NTA亲和层析技术测定外源或内源性 SUMO化的 ANXA1，用免疫印迹实验（Western blot）检测特定处理下特定分子的蛋白表达结果；
（5）利用免疫共沉淀技术(Co-IP)检测中特定处理下指定的两种蛋白质的结合情况。
【结果】：
（1）原代培养的小胶质细胞经OGD/R处理后SUMO2和Ubc9的 mRNA表达水平显著升高。
（2） SUMO2 是 ANXA1 SUMO 化的主要 SUMO 蛋白；外源性 ANXA1 和SUMO2有实际结合，内源性的ANXA1也能被SUMO2所SUMO化，因此在后期的ANXA1的SUMO化修饰研究中我们以SUMO2为主要的SUMO蛋白研究对象；
（3）上调Ubc9可以促进ANXA1的SUMO化修饰，上调Ubc9后ANXA1与Ubc9的结合增多，在ANXA1的SUMO化修饰中，Ubc9发挥着十分重要的作用；
（4）过表达PIAS3对ANXA1的SUMO化相比于其他类型的E3酶有更好的促进效果，外源性ANXA1与PIAS3确实有实际结合；
（5）第113位，第161位和第257位赖氨酸是ANXA1发生 SUMO化的主要位点，干预其中任意一个／两个／三个位点都会明显降低甚至阻断ANXA1的SUMO化，同时突变这三个位点后ANXA1与SUMO2的结合完全消失；上调Ubc9或者PIAS3水平均能促进ANXA1 SUMO化，突变掉ANXA1 SUMO化位点（ANXA1-3KR ）后不论是在正常生理状态还是上调Ubc9或者PIAS3水平，ANXA1均不发生SUMO化。
【结论】：
本研究证实了在HEK293细胞中，ANXA1 SUMO化相关的主要SUMO蛋白是SUMO2，上调E2连接酶Ubc9能够促进ANXA1 SUMO化，ANXA1 SUMO化中促进作用效果最佳的E3酶是PIAS3，ANXA1与SUMO2作用发生SUMO化的主要位点是第第113位，第161位和第257位赖氨酸。