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羊奶含有丰富的短中链脂肪酸与不饱和脂肪酸,该特性构成羊奶独特的营养保健功效,在婴幼儿、老年、恢复期病人以及肠道不适人群的营养保健中发挥着重要作用。山羊乳腺作为重要的泌乳器官,乳汁中脂肪酸的成分及含量主要受到乳腺组织中脂肪酸代谢的调控。Micro RNA（miRNA）作为一种重要的表观调控因子参与脂质及蛋白质合成以及新陈代谢乃至于肿瘤发生发展等多方面作用。miRNA通过影响脂肪酸代谢关键基因的表达调控乳腺组织的脂肪酸代谢过程,其具体的调控机制对于深入解析羊奶脂肪酸代谢的分子机制具有重要意义。因此,利用先进手段探究miRNA在乳腺脂肪酸代谢中的功能对于全面揭示miRNA调控羊奶脂肪酸代谢的分子机理具有重要意义。CRISPR/Cas9系统因其设计简便、编辑效率高与脱靶频率低等特点被广泛运用于高通量与多重基因编辑中,近年来在非编码RNA研究领域取得了巨大的进展。本研究在分析泌乳中期乳腺组织14个乳脂代谢相关miRNAs及其宿主基因表达水平与乳中脂肪酸成分相关性的基础上,选取与乳中短链及长链脂肪酸含量显著相关的两个促进乳脂合成的miR-145与miR-24以及一个抑制乳脂合成的miR-130b。通过CRISPR/Cas9技术敲除miRNAs以探究miRNAs敲除对乳腺上皮细胞脂肪酸代谢的影响。验证山羊乳腺上皮细胞中miRNAs调控脂肪酸代谢的靶基因,分析miRNAs通过靶基因影响乳腺脂肪酸代谢的分子机制。研究主要结果如下所示:1.山羊乳脂代谢相关miRNAs及其宿主基因表达水平与羊奶脂肪酸成分的相关性分析泌乳中期14个乳脂代谢相关miRNAs表达水平与乳中脂肪酸成分的相关性分析表明,miR-145、miR-30e、miR-24和miR-130b等四个miRNAs与羊乳中C6-C10脂肪酸含量具有负相关关系。14个miRNAs除miR-15a、miR-17以及miR-135b之外均与乳中长链脂肪酸含量显著相关。超长链脂肪酸中,仅有miR-148a与C20:4n6、miR-130b与C24:1n9存在显著相关。宿主基因表达水平与乳中脂肪酸成分的相关性分析表明,miRNA宿主基因中,NFYC与C18:0、CTDSPL与C14:0、CTDSP1与C18:0、NR6A1与C13:0以及PANK2与C21:0脂肪酸含量显著相关。结果表明,miRNAs与乳中短链及长链脂肪酸成分相关。2.miR-145通过INSIG1基因调控山羊乳腺上皮细胞的脂肪酸代谢山羊乳腺上皮细胞中利用CRISPR/Cas9技术敲除miR-145。通过在pre-miR-145基因组序列的Drosha酶的加工位点附近缺失一个核苷酸,影响miRNA的生物合成过程从而抑制成熟miR-145-5p与3p表达。miR-145敲除通过促进靶基因INSIG1 m RNA与蛋白质表达并抑制脂肪酸代谢关键基因表达从而抑制细胞中的甘油三酯与胆固醇合成并上调C17:0、C18:0、C18:2、C20与C22多不饱和脂肪酸且下调C16:0与C18:1脂肪酸含量。此外,利用si RNA在miR-145敲除细胞中干扰INSIG1基因表达,甘油三酯与胆固醇含量均上调,且脂肪酸含量也发生相应改变。结果表明,山羊乳腺上皮细胞中利用CRISPR/Cas9技术敲除miR-145通过上调靶基因INSIG1并抑制脂肪酸代谢相关基因表达继而抑制细胞中的甘油三酯与胆固醇合成并影响脂肪酸组成。3.miR-24靶向INSIG1与FASN基因调控乳腺上皮细胞的脂肪酸代谢山羊乳腺上皮细胞中利用CRISPR/Cas9技术敲除两条sg RNAs靶向位点间的66个核苷酸,从而导致miRNA的生物合成过程受阻并抑制成熟miR-24表达。miR-24敲除促进靶基因FASN与INSIG1表达并抑制脂肪酸代谢关键基因表达从而抑制脂滴、甘油三酯与胆固醇合成并上调C17:0、C18:0、C18:2与C20多不饱和脂肪酸含量。通过在miR-24敲除细胞中干扰FASN与INSIG1表达,发现干扰FASN基因表达进一步抑制甘油三酯合成,而干扰INSIG1基因表达恢复敲除细胞中脂滴、甘油三酯、胆固醇以及C16:0、C16:1与C18:0脂肪酸含量。总之,山羊乳腺上皮细胞中敲除miR-24主要通过靶向INSIG1基因抑制脂滴、甘油三酯、胆固醇合成并调控脂肪酸组成。4.miR-130b靶向PGC1α基因并影响乳腺上皮细胞的脂肪酸代谢利用双sgRNAs介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统在山羊乳腺上皮细胞中敲除pre-miR-130b的43个核苷酸,pri-miR-130b表达水平上升而pre-miR-130b表达水平下降,表明pri-miRNA的Drosha酶的加工过程得到了抑制。miR-130b敲除通过上调靶基因PGC1α与脂肪酸代谢关键基因的表达促进细胞中脂滴、甘油三酯、胆固醇合成并下调C16、C18、C20与C22脂肪酸且上调C17:0脂肪酸含量。总之,在山羊乳腺上皮细胞中敲除miR-130b通过靶向PGC1α基因并促进脂肪酸代谢关键基因表达进而促进脂滴、甘油三酯、胆固醇合成并影响脂肪酸组成。综上所述,利用CRISPR/Cas9技术敲除pre-miRNA基因组序列,通过影响miRNA的生物合成过程抑制成熟miRNA表达并调控靶基因与脂肪酸代谢关键基因的表达进而调节脂滴、甘油三酯与胆固醇合成并影响C18:0、C18:2与C20多不饱和脂肪酸含量。本研究为阐明miRNA调控羊奶脂肪酸代谢的分子机制提供了理论依据,为miRNA转基因奶山羊制备提供研究基础。