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目的：帕妥木单抗(Panitumumab)是一种已上市的特异性靶向表皮生长因子受体(EGFR)的抗体。然而由于其是一种IgG2亚类抗体,抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)较弱。因此我们将帕妥木单抗的可变区移植到IgG1亚类的骨架区后得到新型抗体Pan,以提高其ADCC活性。接下来,利用ProbodyTM技术对Pan进行改造，构建了可被尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)激活的新型前抗体Pan-P,以期能减轻抗EGFR抗体引起的毒副反应。综上所述,本课题旨在构建具有强抑瘤效能且可被选择性激活的前抗体,以达到在增强疗效的同时降低其皮肤毒性的目的。方法：首先,利用基因工程技术将帕妥木单抗的可变区基因连接到IgG1亚类抗体Fc段,转入CHO细胞中表达、纯化得到新型抗体Pan。利用以下手段对其进行表征分析：SDS-PAGE等分析其分子量和纯度；Biacore和ELISA测定抗体的亲和力和抗原结合力；CCK-8试验测定抗体对A431细胞的生长抑制效应；LC-MS测定Pan的糖型比例；ADCC报告基因试验评估其体外ADCC活性。最后,在荷瘤小鼠体内评估其抑瘤活性。其次,利用ProbodyTM技术对Pan抗体进行改造。改造方法为在其轻链N端添加了封闭肽、连接肽及酶切底物肽等序列而得到了前抗体Pan-P。利用以下方法对其进行表征分析：SDS-PAGE、LC-MS分析其可被uPA特异性酶切的特性；Biacore、ELISA及FACS表征其可被uPA酶切且激活的特性；CCK-8试验测定其激活后对A431及DiFi细胞生长抑制的活性；冰冻组织原位染色技术评估Pan-P在结直肠癌患者肿瘤组织的酶切激活特性；同时在荷瘤小鼠体内评估Pan-P的酶切激活后靶向性。最后,在荷瘤小鼠体内评估其抑瘤活性。结果：我们获得了Pan抗体,经分析其纯度大于99%。经测定,Pan的亲和力约为7.4×10-10M,与帕妥木单抗相似。同时,CCK-8试验也证实其保持了帕妥木单抗对A431细胞的生长抑制效能。更重要的是,我们发现在Pan的糖型比例中,非岩藻糖修饰的糖型比率为33%左右,这可能有助于增强其ADCC活性。在ADCC报告基因试验中,Pan介导ADCC效应的效能显著高于帕妥木单抗。尤其值得注意的是,Pan显示的体内抑瘤效能较之帕妥木单抗更强。在此基础上改造得到的前抗体Pan-P可被酶切激活而恢复完全功能活性。具体结果如下：SDS-PAGE、LC-MS等试验证实uPA可对Pan-P进行特异性酶切。Biacore、ELISA及CCK-8等试验证实Pan-P可被酶切激活而恢复与Pan相似的功能活性。更重要的是，Pan-P在结直肠癌患者肿瘤组织中亦可被酶切激活。最后,在荷瘤小鼠体内证实了Pan-P的靶向性及抑瘤活性。结论：综上所述,我们最终得到了具有酶激活特性及增强的抗肿瘤效能的前抗体Pan-P。未来用于结直肠癌等的治疗时,将有望增强治疗效果并缓解抗EGFR拮抗剂对正常组织的毒性,提升治疗指数。