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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)作为生物体内重要的辅酶和核心代谢产物,参与细胞内的糖酵解和三羧酸循环等诸多能量代谢过程中的氧化还原反应,在细胞代谢途径和能量转移中起着至关重要的作用。NADH主要来源包括在细胞质中进行的糖酵解过程和在线粒体中进行的三羧酸循环,其浓度变化可直接表征细胞内的代谢状态。因此,可通过实时监测细胞内NADH的动态变化,来指示细胞内代谢途径的运转和细胞的生理状态。本课题利用基因工程和合成生物学等技术构建完成一个新的遗传编码荧光探针,并将其应用于检测细胞内NADH的浓度变化,为NADH及其功能相关的研究提供了新的方法。古细菌中的嗜酸热原体菌(Thermoplasma acidophilum)硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白(Thioredoxin,Ta-Trx)和硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase,TaTrxR),其中Ta-TrxR是一种与NADH电子传递相关的黄素蛋白,其主要作用是利用NADH提供的电子还原氧化型的Ta-Trx,生成还原型的Ta-Trx用于还原胞内含有二硫键的靶蛋白,进而参与调控生物体内众多的生理生化反应。本研究基于上述嗜酸热原体菌的硫氧还蛋白系统,发展了一个新的NADH特异性遗传编码荧光探针。我们将Ta-Trx与氧化还原敏感的红色荧光蛋白(rxRFP)通过多肽形成一个融合蛋白TrxRFP,然后将Ta-TrxR和TrxRFP的编码序列分别构建到同一个真核表达载体上,使二者在细胞内独立表达。当细胞内NADH水平升高时,在Ta-TrxR催化下将NADH的电子传递给氧化型的Ta-Trx,使Ta-Trx被还原。还原型的Ta-Trx进一步还原rxRFP中的二硫键,rxRFP由氧化状态转换为还原状态,其荧光强度会显著减弱。据此,我们可通过检测红色荧光强度的变化来监测细胞内NADH的动态变化。目前我们已将所构建的荧光探针在人源胚胎肾(Human embryonic kidney,HEK)293T细胞中表达,并对其专一性、响应时间、灵敏度以及动态变化范围进行评估。细胞成像结果显示,我们构建的荧光探针对NADH具有专一性,并能指示细胞内NADH的动态变化。本课题构建完成一个新的NADH特异性遗传编码荧光探针,并将其应用于哺乳动物细胞中NADH的动态检测。我们尝试将嗜酸热原体菌中的硫氧还蛋白系统应用到遗传编码的荧光探针中,为今后发展多元化遗传编码荧光探针提供了新的思路和方向。