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研究背景和目的：自身免疫反应所致胆管进行性炎性损伤是胆道闭锁(BA)重要发病机制。前期研究发现BA患儿汇管区有大量Foxp3+Treg浸润,其具有异质性,包含有致炎效应的IL-17+Foxp3+Treg亚群。文献报道,表观遗传学修饰是调控Foxp3表达的重要机制。我们推测BA汇管区细胞因子(TGF-β、IL-6等)消长可通过表观遗传学机制调控T细胞FoxP3基因表达,诱导IL-17+FoxP3+Treg分化并分泌IL-17A,从而介导胆管损伤。鉴此,本项目拟开展如下研究：①动态观察BA小鼠模型肝脏微环境细胞因子(TGF-β、IL-6等)表达特点、Treg细胞Foxp3基因启动子DNA甲基化状态,以及对Foxp3基因表达、Treg细胞亚群分化的影响；②用DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deo-xycytidine, Aza)修饰Foxp3基因,观察肝脏炎症环境中不同Treg细胞亚群功能状态及其与胆管损伤相关性。明确BA小鼠模型中IL-17+Foxp3+Treg形成以及参与胆管损伤机制。研究方法：第一部分：SPF级Balb/c小鼠随机分为正常对照组和BA组,BA组小鼠出生后12小时内腹腔注射恒河猴轮状病毒(RRV)建立胆道闭锁模型。于出生小鼠第4天、第7天、第10天处死(BA组和对照组)并摘取肝脏。动态检测小鼠肝脏组织中炎性细胞因子(INF-γ、IL-6、IL-17A、IL-23)和抑炎性细胞因子(IL-10、TGF-β的变化；IL-17+FoxP3+Treg细胞、IL-17-Foxp3+Treg细胞的分布特点、细胞绝对数和占CD4+T细胞的比例；以及Foxp3基因启动子CpG岛甲基化变化水平。第二部分：SPF级Balb/c小鼠随机分为正常对照组、BA组和Aza干预组,BA组小鼠出生后12小时内腹腔注射恒河猴轮状病毒(RRV)建立胆道闭锁模型,Aza干预组在新生鼠RRV建模后连续4天腹腔注射甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine, Aza),分别观察三组小鼠出生第4天、第7天、第10天观察肝脏组织中炎性细胞因子(INF-γ、IL-6、IL-17A、IL-23)和抑炎性细胞因子(IL-10、 TGF-β)的变化,Foxp3基因启动子CpG岛甲基化水平,IL-17+FoxP3+Treg细胞、IL-17-Foxp3+Treg细胞和Th17细胞的比例,以及对胆管炎症损伤和小鼠生存率的影响。实验结果：第一部分：BA组所检测各细胞因子在第4天表达量逐渐上升,在第7天达到峰值,与对照组相比,IL-6表达量升高31倍、IL-10提高了6倍、INF-γ提高了11倍,TGF-β提高了3.2倍,差异具有统计学意义(P<0.05)；IL-17、IL-23第4天含量逐渐上升,第10天达到峰值,与对照组相比,IL-17为6倍,IL-23为4倍,差异具有统计学意义(P值分别为P<0.001,P<0.01,P<0.05,P<0.05)。流式细胞仪检测BA组小鼠肝脏淋巴细胞中IL-17-Foxp3+Treg、IL-17+Foxp3+Treg/CD4+细胞比例及绝对数,从第4天开始升高,第7天达到峰值,随后逐渐下降,各时间点均较对照组升高(P值均小于0.05)；免疫荧光组织化学显示第7天BA组小鼠肝脏汇管区存在大量IL-17-Foxp3+Treg、 IL-17+Foxp3+Treg细胞(P<0.05)。流式细胞仪检测BA组小鼠肝脏淋巴细胞中IL-17+ToxP3+Treg/CD4+细胞比例从第4天开始升高,第7天达到峰值,随后逐渐下降,各时间点均较正常对照组明显升高(P<0.05)；从细胞绝对值来看,第7天、第10天BA小鼠IL-17+Foxp3+Treg细胞、IL-17-Foxp3+Treg细胞数量明显高于正常对照组(P<0.05)。亚硫酸氢盐测序法(BSP)显示BA组第4天、第7天、第10天肝脏组织中FoxP3+Treg细胞中Foxp3基因启动子CpG岛甲基化程度逐渐增高(第10天略有下降)且均高于正常对照组(P<0.05)。第二部分：Aza干预组小鼠肝脏中细胞因子IL-6、INF-γ、IL-17、IL-23在第4天、第7天、第10天较BA组小鼠中的表达下降明显,且具有统计学意义(P<0.05)；Aza组细胞因子IL-10和TGF-β含量在第7天较BA组升高(P<0.05),并持续升高第10天。流式细胞术检测显示,第7天Aza干预组IL-17+FoxP3+Treg细胞比例和Th17占CD4+比例较BA组开始出现下降(P<0.05)；第7天、第10天Aza组IL-17+FoxP3+Treg细胞、Th17细胞的绝对数值低于BA组(P值均小于0.05)。BSP显示Aza干预组第4天、第7天、第10天Foxp3+Treg细胞中Foxp3基因启动子CpG岛甲基化均低于对照组(P<0.05)。HE组织病理学染色显示,第4天、第7天、第10天Aza干预组肝脏汇管区组织炎性病理损伤较BA组均减轻。Aza干预组小鼠的生存率较BA组回升(P<0.05)。实验结论：1、RRV诱导的小鼠胆道闭锁模型中,肝内胆管微环境中炎性细胞因子和IL-17+Foxp3+Treg细胞发生着先升高后逐渐下降的变化。其中INF-γ、IL-6、IL-10、TGF-β细胞因子早于IL-17、IL-23细胞因子达到峰值。而Foxp3基因持续保持高DNA甲基化水平。2、微环境中IL-6可上调Foxp3基因启动子DNA甲基化,IL-6和TGF-β共同作用可能是促进IL-17+FoxP3+Treg细胞分化形成炎性Treg细胞并参与BA胆管损伤的重要原因。3、DNA甲基化抑制剂(Aza)可下调Foxp3基因甲基化水平,减少IL-17+Foxp3+Treg细胞产生,抑制炎性因子(IL-17A)的产生,从而减轻BA胆管损伤。