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本实验对日本七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺cDNA文库1323条有效EST序列进行分析,得到一条能够翻译TCTP模体的开放阅读框,据此设计引物,以日本七鳃鳗口腔腺总RNA为模板进行RT-PCR扩增,得长为519bp的目的基因,与pET23b载体连接后,在大肠杆菌BL21中成功表达,亲和层析纯化后得到浓度约为1.5mg/mL的L-250蛋白纯品。以获得的L-250蛋白纯品制备多克隆抗体,进行免疫印迹实验,分析抗体与目的蛋白结合的特异性,同时对表达的重组蛋白在日本七鳃鳗口腔腺中进行定位。活性实验表明L-250蛋白具有组胺释放因子(Histamine-releasing factor,HRF)生物学功能。首先,通过基因工程的手段从日本七鳃鳗口腔腺中获得了受翻译调节的肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)的目的基因,克隆至pET23b表达载体上,再转化入克隆菌DH5α后进行阳性转化子的筛选,之后将带有组氨酸标签的重组蛋白在E.coli BL21中进行了可溶性表达,经组氨酸亲和层析柱纯化后,获取了分子量为22.4kD的TCTP纯品,将其命名为L-250。以纯化的L-250蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备兔抗七鳃鳗血清L-250蛋白多克隆抗体,ELISA法检测多克隆抗体效价可达1:6400。以日本七鳃鳗口腔腺分泌物和表达的重组蛋白纯品行SDS-PAGE,采用免疫印迹法进行检测,发现制备的兔抗七鳃鳗血清L-250蛋白多克隆抗体能够与口腔腺分泌物和重组蛋白均发生明显的特异性结合,L-250蛋白是一种分泌蛋白。采用大鼠嗜碱性白血病细胞系RBL-2H3评价L-250蛋白的HFR活性。将L-250以不同的浓度梯度(0.3,4.8,10μg/mL)与RBL-2H3孵育,结果表明, L-250能够刺激RBL-2H3释放组胺,并且在痕量(0.3μg/mL)下就能够起作用。由此可以推测,组胺作为一种免疫介质,七鳃鳗这种寄生性生物可以通过L-250蛋白使宿主产生免疫反应,组胺还能够引起血管扩张效应,增强局部血流;另一方面,组胺还能够增强血管内皮细胞表面凝血酶调节素TM的表达,凝血酶调节素与凝血酶结合,可降低凝血酶的凝血活性,同时活化蛋白C,活化的蛋白C能够水解凝血因子Ⅴa和Ⅷa,并且阻碍凝血因子Ⅹa与血小板的结合,还能够促进纤维蛋白溶解,这三条通路最终都会抑制凝血反应。这为解释日本七鳃鳗的吸血生活习性提供了一定的理论依据,同时,提示L-250蛋白将在临床抗凝治疗方面具有潜在的应用价值。