端粒是位于染色体末端的保护性结构。在哺乳动物中,端粒DNA由一段含有数千个（TTAGGG）n/（CCCTAA）n重复单元的双链和3’末端突出的长度为50～500 nt的（TTAGGG）n单链组成。3’末端突出部分能够形成G-四链体结构,同时也可以入侵端粒DNA的双链部分,从而形成T-loop结构。端粒DNA的双链部分包含富含鸟嘌呤的单链（G-链）和富含胞嘧啶的互补链（C-链）,两条链均有机会形成高级结构（G-链可形成G-四链体结构,C-链可形成i-motif结构）,因此具有着异于普通DNA的结构多样性。这段特殊的重复序列虽然不携带任何的遗传信息,但却关乎着细胞的衰老,同时与癌症致病机理有着密切的关系。结构与功能总是息息相关的,端粒DNA的结构性质一直备受人们关注,但有碍于重复序列合成的困难性和长串联结构的复杂性,导致人们对长链端粒DNA的拓扑结构以及长串联G-四链体的认识并不全面。因此接近真实长度的端粒DNA序列的结构有待于我们进一步探究,这也有助于为设计新型抗癌药物提供新的思路。本文中,我们利用滚环扩增、EM-PCR与TA克隆结合的方法分别制备了长单链端粒序列和长双链端粒序列;利用基于原子力显微镜技术的单分子力谱方法并结合圆二色谱、变温紫外、凝胶电泳等传统研究方法,对长链端粒DNA的结构和性质以及G-四链体与TRF2蛋白的相互作用展开了系统研究。论文取得以下主要研究成果:一、我们利用基于原子力显微镜技术的单分子力谱技术和圆二色谱技术对长度为大于10 knt的人体端粒序列（TTAGGG）n在K+溶液中折叠形成的结构以及折叠机制进行了系统的探究。发现在长串联结构中存在一种新型的G-四链体中间体,我们将其命名为前四链体（pre-GQ）结构。与完整的G-四链体结构相比,pre-GQ结构中5’和3’末端均缺失2-3个鸟嘌呤（G）。同时根据pre-GQ中空缺位置的数量（4个和2个,）将其分为两类（I型和II型）。串联pre-GQ的解折叠力值比单个完整G-四链体结构的解折叠力值低约10 pN,说明pre-GQ中的空缺位置降低了它的力学稳定性。通过对同一根长单链端粒DNA的往复拉伸-松弛操纵来探究长串联结构解折叠后重新折叠的过程,发现长单链端粒序列的折叠涉及两步:首先从单链DNA快速折叠形成串联的发卡结构;随后,外侧未参与折叠的鸟嘌呤缓慢地折叠进入空缺位置中,最终形成含有I型、II型pre-GQ和完整G-四链体的串联混合结构,40%PEG的存在（模拟细胞拥挤环境）可以加速这一过程。该实验结果有助于人们更好的认识体内环境下端粒末端的真实结构,为抗癌药物的设计提供新的思路。二、利用单分子力谱技术探究了影响长双链端粒DNA拓扑结构的因素。首先我们开发了一种能够在体外合成单一长度的双链重复序列的方法;随后利用单分子力谱、圆二色谱和变温紫外等方法对双链端粒DNA在不同条件下的拓扑结构进行了系统的探究。发现长度为700 bp的双链端粒DNA的性质与长度为21 bp的端粒序列完全不同,前者可以稳定存在于含有K+的酸性溶液中,只有当机械外力诱导后,长双链端粒DNA的拓扑结构才会发生改变。当机械力诱导双链端粒DNA解链后,打开的双链在形成高级结构（G-四链体或i-motif结构）和再次复性之间存在竞争关系。研究发现,只有在两条链分别形成G-四链体和i-motif结构的条件下,双链端粒DNA的再次复性才能被有效阻止。溶液中引入K+、单壁碳纳米管、酸性条件或是富含G的短片段（～30 nt）均有利于实现将平衡从双螺旋复性向高级结构形成方向转移。由于机械力广泛存在于DNA复制、转录等多个重要生物过程中,所以我们的实验结果可以帮助人们了解受力后的端粒DNA拓扑结构变化的规律,对于抗癌药物的设计和端粒DNA拓扑结构的调控等相关研究也具有一定的指导意义。此外,该方法还可以用于研究其它含有重复序列的长链DNA。三、利用单分子力谱技术探究了G-四链体结构与TRF2蛋白之间的相互作用。TRF2蛋白作为端粒结合蛋白中重要的一员,其对于T-loop的形成以及端粒结构的稳定都有着重要作用。首先,我们通过AFM成像技术发现TRF2蛋白与G-四链体之间存在着相互作用;随后利用单分子力谱技术研究TRF2蛋白对G-四链体结构稳定性的影响,发现G-四链体与TRF2蛋白结合后,解折叠力值降低。利用Jarzynski等式计算打开单个G-四链体所需自由能,发现结合TRF2蛋白后,单个G-四链体解折叠所需自由能降低,说明TRF2蛋白会降低G-四链体结构的稳定性。猜测这可能是TRF2蛋白有利于稳定T-loop结构的原因之一。