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近年来,用手性技术不对称催化合成手性化合物及其手性中间体已经引起了学术界和企业界的重视,成为研究开发的热点。利用微生物酶进行不对称催化反应,具有反应条件温和、转化率高及立体选择性好等优点,已成为诸多手性合成方法的首选。本文着眼于基因工程改造菌微生物转化不对称生产d-伪麻黄碱所遇到辅酶再生的问题,以当前应用广泛的葡萄糖脱氢酶和甲酸脱氢酶为辅酶再生的酶,与能够专一性转化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(简称MAK)为d-伪麻黄碱的羰基还原酶分别构建共表达质粒,以达到辅酶在细胞体内再生的目的。本文以重组质粒pET28a-mldh为模板,通过PCR扩增得到羰基还原酶基因mldh,构建了重组大肠杆菌E.coli JM109 (pKK223-mldh)。以枯草芽孢杆菌基因组为模板,采用PCR的手段扩增得到葡萄糖脱氢酶基因gdh与已构建好的pKK223-3-mldh连接,转化E. coli JM109获得重组菌E. coli pKK223-3-gdh-mldh。SDS-PAGE结果表明羰基还原酶及葡萄糖脱氢酶均有表达其相对分子质量分别为43 kD和31 kD。液相检测重组菌细胞破碎液在不添加外源的葡萄糖脱氢酶的情况下能专一性转化MAK为d-伪麻黄碱。全细胞转化实验表明0.1 g湿菌体与0.1 mg MAK及4 mg葡萄糖30℃反应10 h生成0.058 mg d-伪麻黄碱。以博伊丁假丝酵母为模板扩增得到甲酸脱氢酶基因fdh,与构建好的pKK223-3-mldh连接,转化E. coli JM109获得重组菌E. coli pKK223-3-pro-fdh-mldh。液相检测重组菌细胞在外加甲酸钠的情况下能专一性转化MAK。全细胞转化实验中,0.1g培养时间为8h的该重组菌在外加3 mg的甲酸钠的情况下与0.09mg的MAK反应生成0.0371mg的d-伪麻黄碱。与羰基还原酶单基因重组菌外加葡萄糖脱氢酶转化MAK比较pKK223-3-mldh-gdh共表达质粒转化株和pKK223-3-mldh-pro-fdh共表达质粒转化株羰基还原酶的比酶活相对都较低。两个共表达质粒转化菌在外加相应的辅助底物的情况下都能在细胞内实现辅酶的再生,而葡萄糖脱氢酶共表达质粒转化菌株产物产量要高于甲酸脱氢酶共表达质粒转化株。