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山楂叶是一味重要的中药材,是蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var。major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥叶。山楂叶价格低廉,资源丰富。研究表明,其具有降压、增加冠脉流量、降低血脂、耐缺氧等作用,尤其在预防和治疗心血管疾病,高血脂症等方面疗效显著。
山楂叶中的化学成分包括黄酮类化合物、有机酸及微量元素等,其中黄酮类化合物是山楂叶中的主要化学成分,生药鉴别和药品质量评价也均以黄酮类成分为指标。其中黄酮类化合物主要包含牡荆素-4"-O-葡萄糖苷、牡荆素-2"-O-鼠李糖苷、、芦丁-4”-O-鼠李糖苷芦丁-4"-O-鼠李糖苷、金丝桃苷、牡荆素、槲皮素等多种化学成分。
本课题以山楂叶为研究对象,结合高效液相色谱跟踪检测对山楂叶总黄酮有效部位的大孔吸附树脂纯化洗脱工艺进行了研究；通过HPLC-DAD-ESI-MS/MS联用技术定性分析山楂叶总黄酮有效部位中的11种主要化学成分及对其指标性黄酮苷裂解规律进行了研究确证；采用高效液相色谱对柱及二维柱切换液相色谱法对山楂叶总黄酮有效部位中三种主要黄酮苷成份进行了分离制备；结合高速逆流色谱与半制备高效液相色谱方法,进一步建立了大量制各三种高纯度黄酮苷单体的技术平台。
具体内容如下：
一、山楂叶总黄酮有效部位的大孔吸附树脂纯化洗脱工艺研究
参考近年来山楂叶总黄酮提取纯化的相关报道,综合分析各种提取方法以及大孔吸附树脂的使用,结合高效液相色谱法跟踪检测着重对大孔吸附树脂纯化工艺中洗脱剂浓度及其用量进行了考察。我们确定了山楂叶总黄酮提取纯化的具体方法是：取干燥山楂叶药材适量,用8倍量60％乙醇加热回流提取2次,每次2小时；过滤,合并滤液,60℃减压浓缩至无醇味,备用。取上述山楂叶粗提物,加水混悬。取活化好的D101大孔吸附树脂上样分离,上样量比例为药材量(g)/树脂量(g)=1:3,样品液浓度为1g/ml;上样完毕后先静态吸附2个小时,随后用1BV的水和10％乙醇洗脱除杂,再用6BV的20％乙醇解吸,洗脱流速为1BV/h。工艺优化后,固形物得率达3.2％,有效部位总黄酮含量大于70％,指标性成分牡荆素-2-0"-鼠李糖苷含量大于40％,为进-步提高山楂叶总黄酮有效部位的质量标准提供了有益的参考。
二、采用HPLC-DAD-ESI-MS/MS联用技术分离鉴识
山楂叶总黄酮有效部位中的主要化学成分采用高效液相色谱-二极管阵列检测-串联质谱法(HPLC-DAD-ESI-MS/MS)对山楂叶总黄酮有效部位中的11种主要化学成分进行快速定性鉴识。实验结果表明,通过色谱优化,使山楂叶总黄酮有效部位中主要的11种有效成分在五十分钟内达到基线分离。根据供试品的总离子流图,并与有关文献报道及质谱资料比对,初步鉴识山楂叶总黄酮有效部位中11种化合物的可能结构,其中芦丁-4"'-O-鼠李糖苷、牡荆素-4"-O-葡萄糖苷和牡荆素-2"-O-鼠李糖苷为山楂叶总黄酮有效部位中主要的三种黄酮类化合物；结合一级质谱与二级质谱信息对山楂叶总黄酮有效部位中牡荆素-4"-O-葡萄糖苷和牡荆素-2"-O-鼠李糖苷两种主要黄酮成分的裂解规律进行了推测,进一步验证了HPLC-DAD-ESI-MS/MS分离鉴识的可靠性。
三、高效液相色谱对柱线性放大技术分离制备
山楂叶总黄酮有效部位中三种黄酮苷成分本研究使用了相同填料的YMC分析-半制备色谱对柱,先用YMC分析型色谱柱对分离条件进行优化,由于采用的是填料完全相同的YMC制备柱,因此我们在进行分析型到半制备型色谱分离的条件转移时,除将进样量及流速线性放大外,半制备型色谱条件中的流动相组成均与分析型色谱条件一致。按照线性放大规律,将分析柱YMCODS-C18(250 mm×4.6 mm i.d.,5 μm)线性放大到制备柱YMC ODS-C18(250 mm×10.0mm i.d.,5μm),进样量放大到20倍即6mg,流速放大到5倍即3.0 ml/min。通过YMC高效液相色谱对柱的分离制备,从1g山楂叶总黄酮有效部位中可以分离制备得到芦丁-4"'-O-鼠李糖苷30.4mg、牡荆素-4"-O-葡萄糖苷61.3mg、牡荆素-2"-O-鼠李糖苷271.7mg,由HPLC纯度检测结果可知三种黄酮苷单体纯度均大于95％。
四、搭建二维柱切换制备液相色谱系统,建立山楂叶总黄酮有效部位中三种黄酮苷成分纯化分离的HPLC-HPLC高效、快速在线分析制备技术
以六通切换阀代替传统定量蓄积环,使得从一维到二维的切割体积不再受定量环容积的限制,扩大了方法的应用范围；同时保证样品组分在二维色谱柱之间100％的切换率,极大地提高了分离的效率。当加大进样量时,在第一维制备柱中难以与干扰组分分离的牡荆素-4"-O-葡萄糖苷和牡荆素-2"-O-鼠李糖苷在线切换到第二维制备柱中进行分离,结合连续进样大幅度减少单次分离制备的消耗时间和消耗溶剂,从而建立了山楂叶总黄酮有效部位中三种黄酮苷成分分离纯化的HPLC-HPLC高效、快速在线分析制备技术。从1g山楂叶总黄酮有效部位中分离制备一次性得到芦丁-4"'-O-鼠李糖苷33.9mg、牡荆素-4"-O-葡萄糖苷66.3mg、牡荆素-2"-O-鼠李糖苷295-3mg。由HPLC纯度检测结果可知三种黄酮苷单体纯度均大于98％。
五、采用高速逆流色谱与高效液相色谱相结合技术,建立大量制备山楂叶总黄酮有效部位中三种高纯度黄酮苷单体的HSCCC-HPLC技术平台
本文首次提出了一种全新的高速逆流色谱与高效液相色谱相结合的分离策略实现山楂叶总黄酮有效部位中三种指标性黄酮苷单体的大量制备,即利用两者互不相同的分离机理将山楂叶总黄酮有效部位先经高速逆流色谱分离切割为四部分流份,再利用制备高效液相色谱进行目标化合物的分离制备。该方法比单纯使用制备高效液相色谱法分离效率高、分离效果好,从而获得了高纯度的目标化合物。HSCCC-HPLC结合分离制备技术平台包括：
(1)提出一种全新的高速逆流色谱溶剂体系快速优化策略,即将传统的分配系数静态测定与分析型高速逆流色谱两相体系动态筛选相结合,用于制备型高速逆流色谱溶剂体系的优化。首先采用分配系数测定法对溶剂体系进行初筛,继而通过分析型高速逆流色谱分离过程将初筛后得到的溶剂体系进一步优化,最后将优化后所得到的最佳溶剂体系微调放大到制备型高速逆流色谱仪。
(2)在此基础上,将高速逆流色谱法与半制备高效液相色谱法相结合,先利用高速逆流色谱进行分离制备,根据检测图谱接收目标成分。通过HSCCC一次性分离制备从200mg山楂叶总黄酮有效部位中得到牡荆素-2"-O-鼠李糖苷单体75.3mg,峰纯度为99.3％；再应用制备液相色谱法进一步分离纯化不纯洗脱流份,可分离得到芦丁-4"'-O-鼠李糖苷11.3mg、峰纯度为98.5％和牡荆素-4"-O-葡萄糖苷22.1mg、峰纯度为98.8％。