重组大肠杆菌全细胞转化L-苯丙氨酸合成苯乳酸的研究

来源 :江南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lok119119119
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)是一种广泛存在于自然界中的小分子天然有机酸,它能够抑制多种食源性致病菌。大量研究表明苯乳酸是一种广谱抗菌物质,且抑菌活性强于一些常用的化学食品防腐剂,因此有望成为食品领域中一种新型生物防腐剂。早期研究中,主要是利用微生物的代谢生产PLA,这种生产方法存在生产周期长、发酵产物不均一、产量低等缺点,因此,近几年人们将研究方向转移到了生物催化法制备PLA,虽然取得了一定的成果,但仍然存在以下不足之处:(1)多以价格昂贵的苯丙酮酸(PPA)为底物,不利于大规模工业化生产;(2)现有研究中,苯乳酸合成过程中所用的酶催化效率低,导致PLA转化率和产量低;(3)乳酸脱氢酶催化过程中需要不断消耗体系中的NADH,NADH价格也很昂贵,额外添加会使成本显著增加。为了解决以上问题,本研究通过共表达L-氨基酸脱氨酶(L-AAD)、乳酸脱氢酶(LDH)和甲酸脱氢酶(FDH),构建了高产PLA的重组大肠杆菌BL21(DE3)(p RSF-aad-ldh10-fdh),它可以利用价格更便宜的苯丙氨酸(Phe)为底物,高效转化生产PLA。首先克隆了来源于奇异变形杆菌Proteus mirabilis KCTC 2566的L-AAD三点突变体D165K/F263M/L336M,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。然后利用生物信息学技术,在GenBank数据库中筛选获得了10种不同来源、具有一定序列差异的编码乳酸脱氢酶的基因。为了在10种基因中选择出活性最高的一种,我们将L-AAD分别与获得的乳酸脱氢酶共表达,构建了10株重组大肠杆菌BL21(DE3)(p RSF-aad-ldh),通过比较10种LDH的蛋白表达量和10株重组大肠杆菌产PLA的能力,选择出了活性最高的乳酸脱氢酶,即来源于Lactobacillus sp.CGMCC 9967的LDH10作为后续的研究对象。为了构建一种副产物少、更加稳定的辅酶NADH再生系统,本文选择了来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidini)的CbFDH再生辅酶NADH,首先采用酶偶联的方法将LDH10和FDH融合表达,然后与L-AAD共表达,构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)(pRSF-aad-ldh10-fdh),经IPTG诱导后,L-AAD、LDH10和FDH均在大肠杆菌中成功表达。为了使重组大肠杆菌BL21(DE3)(p RSF-aad-ldh10-fdh)更加高效利用Phe合成PLA,本文对乳酸脱氢酶基因ldh10前的RBS序列进行了优化,最佳RBS序列为5’-TTAATAAGGAGATATA-3’。并在摇瓶水平上对重组大肠杆菌BL21(DE3)(pRSF-aad-ldh10-fdh)的发酵条件和全细胞转化条件进行了优化,确定发酵条件为:种龄为9 h,接种量为4%,IPTG诱导剂浓度为0.4 mmol?L-1,诱导温度和时间为25oC诱导10 h;确定全细胞催化条件为:转化体系pH为7.0,温度为37oC,共底物甲酸铵的添加量为Phe的2倍摩尔当量,底物Phe与全细胞催化剂的添加比例为4:3(g?L-1),当底物Phe浓度大于等于30 g?L-1,需添加90 mmol?L-1葡萄糖。在上述条件下,重组大肠杆菌BL21(DE3)(p RSF-aad-ldh10-fdh)最高可以转化Phe合成30 g?L-1PLA,转化率为100%,时空产率为48.48 g?L-1?d-1。最后,本文研究了重组大肠杆菌BL21(DE3)(p RSF-aad-ldh10-fdh)的稳定性,发现连续传代三次后,合成的PLA产量只下降了3.25%,质粒保有率为99%,传代5次后,PLA产量下降了5.40%,符合工程菌应用于工业生产的要求。
其他文献
见义勇为一直是社会上和法律上所期许的行为,在当事人处于危险得不到救助的情况下,见义勇为行为人往往起着至关重要的作用。然而在现实生活中由于法律保护不健全,事后救济不
摘 要:声乐演唱需要演唱者对音乐作品进行准确的解释和体会,使演唱者自身能够通过其歌声,对音乐作品进行完美的展现。  关键词:演唱艺术;想象力;音乐修养  中图分类号:J616文献标识码:A文章编号:1004-2172(2008)03-0075-02    声乐演唱是一种综合的艺术表现形式,它综合了演唱者的脑力、体力、想象力和表现力。表演者对音乐作品的理解力、感受力、想象力和表现力将随着人的文化底蕴
研究背景及目的:甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是临床中最常见的内分泌恶性肿瘤,近年来其发病率逐年上升,约有10%-15%的PTC患者常出现远处转移和复发,导致其对标准治疗的效果较差,预后不佳。因此,研究PTC形成和发展的分子机制是十分必要的,对寻找PTC治疗新药,提高PTC患者的预后具有重要意义。微小RNA(microRNA,miRNA,miR)是
我国的教育改革已经进入新时代,在新课改理念的指引下,课堂作为教育的主阵地,必须从课堂本身着手,积极探求高效课堂的实现路径,从而促进我国教育改革在新时代的全面发展。初
土壤酶参与土壤中一切复杂生化过程,是影响物质周转和养分元素释放的关键因素,土壤酶活性能指示土壤质量状况和水平。本文选取蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶和碱性磷酸酶作为研究
喷射成形是一种先进的快速凝固材料制备技术,喷射成形7055铝合金相比于传统铸造态材料具有更加优异的综合力学性能,目前该合金已成功应用于国防军工关键部件的制造。然而在实际热加工生产中材料失稳倾向严重,现阶段关于其热加工性能的研究却鲜有报道,为降低生产成本、控制产品质量和进一步提高材料性能,有必要对其热加工性能及其变形机制进行系统性的研究。本文利用Gleeble-3500型热力模拟试验机对不同初始状态