研究背景臭氧（Ozone,O₃）具有强氧化性与不稳定性,在常温常压空气中易还原为氧气（半衰期45分钟）。医用臭氧（Medical ozone,O₂-O₃）是利用医用纯氧制备的臭氧与纯氧的混合气体。与日常生活用和工业用臭氧不同,医用臭氧必须具有很高纯度及O₃浓度剂量的可控性。O₃浓度过高,对组织细胞具有强氧化毒性损伤作用;O₃浓度过低在体内容易被抗氧化物还原,起不到药理学作用。临床常用O₃浓度为20～50μg/ml。近年,国外通用的医用臭氧发生仪已通过SFDA批准[SFDA（Ⅰ）20042540177]引进国内临床应用。医用臭氧发展有近50年历史,但我国临床医生对此较陌生。在欧洲等地医用臭氧广泛用于治疗糖尿病足、创伤及皮肤溃疡的愈合、脑中风、溃疡性结肠炎、关节炎、椎间盘突出症等疾病,其临床疗效得到了充分肯定（为叙述方便,以下凡提及“臭氧”一词均代指“医用臭氧”）。臭氧治疗在矫形外科,特别是治疗疼痛中的应用,与传统治疗方法相比具有其独特的优越性:①创伤小:仅使用19～21G穿刺针,几乎无损伤,所以未见血肿形成、神经根和大血管及腹腔脏器损伤的报道:②术后反应相对较少,除少数患者有短期内疼痛加剧外,大多数无明显反应;③操作简便,本术较其他治疗方法操作更为简便,可减少患者术中痛苦、节约手术时间及减少术者所受的X线辐射量;④费用省,每例手术仅消耗1根穿刺针,医用纯氧及电耗几乎可忽略不计,极其适合我国的国情;⑤年龄适应证范围较广:本术对高龄患者是安全的:⑥可重复治疗:臭氧在体内代谢快,重复治疗无累积效应。临床应用结果表明臭氧治疗具有显著的优越性,但为何迟迟未能真正推广,甚至不被许多医生及患者接受呢?其最根本的原因就是其基础研究远远落后于临床实践,许多作用及机制尚未明了,限制了其临床治疗领域的扩展;尤其是目前尚缺乏有关臭氧治疗安全性的系统的基础研究,成为其发展的瓶颈。因此,医用臭氧安全性的相关研究研究显得尤为重要。目前关于臭氧疗法安全性的研究集中在臭氧对血液及血细胞特别是红细胞的影响方面。臭氧有强烈的氧化作用,接触一定浓度、一定的持续时间会造成机体的损害。虽然血浆中有缓冲系统以及一系列的抗氧化剂存在（如维生素C、尿酸、巯基蛋白、糖蛋白等）,造成臭氧的作用被中和、活性迅速降低,但仍有部分的臭氧在血浆中会生成活性氧（ROS）,在体外血液实验中,ROS可以触发若干生物化学通路,生成的ROS在0.5～1.0分钟内被血浆中的抗氧化系统中和;在接触并溶解在血浆中时,臭氧迅速和抗氧化剂及多不饱和脂肪酸发生反应,级联生成一系列复合物,如过氧化氢、脂质过氧化产物等（其中作用较明显的4—羟壬烯醛能够激活血液、内皮细胞和实质细胞的某些功能,从而发挥对各种疾病的生理功能调节及治疗的效应）。Bocci等的研究表明,医用臭氧浓度小于80μg/ml,血液及红细胞中的缓冲系统、抗氧化系统可以抵抗臭氧对组织、细胞的损伤作用,从而发挥臭氧的治疗作用;当臭氧浓度大于80μg/ml,则易引起组织细胞的损伤,随着臭氧浓度的增加,损伤作用更加明显。蛛网膜下腔、关节腔、腹腔等也存在着一定量的缓冲物质及抗氧化物质,在与臭氧接触时可迅速被激活从而发挥抗氧化效应,抵抗臭氧损伤的作用也较强。而肌肉及周围神经组织所含的组织液极少,因此其抗氧化能力有待研究,医用臭氧治疗时候的安全浓度范围是否可与在血液中或关节腔、蛛网膜下腔中的浓度相同,也有待实验的证实。几乎所有使用医用臭氧进行治疗的医师都宣称,臭氧本身具有强大的消毒、抗菌作用,因此臭氧治疗没有存在感染的风险或风险极低。但国外却有臭氧椎间盘注射引起爆发性败血症的相关报道。这当中存在什么样的问题呢?我们知道,臭氧具有强大的抗菌能力,目前也普遍用于工业及日常生活的消毒处理,特别是自来水的消毒,与传统方法相比,具有效率高、无有害物质残留、经济等优势。臭氧强大的抗菌能力依赖于其强氧化性,抗菌能力的大小和臭氧的浓度以及作用时间密切相关。医用臭氧是由医用纯氧通过各种管道与臭氧发生器连接,通过后者产生的臭氧-氧气混合气体,这些管道在连接时可能造成医用臭氧受污染,医用臭氧制造过程的各个环节及其组件也并不能保证其无菌;而且临床治疗应用的臭氧浓度被严格限制在一个范围以内（医用臭氧浓度＜80μg/ml,通常为20～50μg/ml）,应用的气体体积也受到限制,医用臭氧的剂量也自然受到限制,加上臭氧在机体内迅速与体内抗氧化系统发生作用,其氧化性迅速降低,能否保持其强大的抗菌能力,值得商榷。这存在着两个问题:①医用臭氧中有无细菌等病原体?②如果医用臭氧中有细菌等病原体,在临床应用的条件下,医用臭氧本身能否将其杀灭?这些问题是临床臭氧治疗医师共同关注的问题,在一定程度上影响患者对臭氧治疗的接受程度,成为医用臭氧治疗推广应用的一个阻碍。但目前国内外尚未见相关报道。目的1.通过相关细菌培养实验,探讨医用臭氧中是否含有细菌,以及在注射进机体后,是否仍保持其强大的抗菌能力;2.通过观察医用臭氧注射后,对大鼠坐骨神经功能、结构的影响,来评价不同浓度医用臭氧在周围神经周围注射的安全性;3.通过观察医用臭氧注射后,不同时间段大鼠臀大肌结构的变化,来评价不同浓度医用臭氧在骨骼肌注射中的安全性。方法1.医用臭氧细菌培养实验部分（1）16只wistar大鼠随机分为4组（n=4）,分别在大鼠的双膝关节腔注射浓度为10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、80μg/ml的医用臭氧0.5ml,其中右膝关节作为实验侧（分别以臭氧10R、臭氧30R、臭氧50R、臭氧80R组表示）,在采集医用臭氧时不使用一次性针头滤器;左膝关节对照侧（以臭氧10L、臭氧30L、臭氧50L、臭氧80L组表示）,在采集时使用一次性针头滤器;24小时后收集关节腔灌洗液送培养。（2）分别在培养皿上方20cm处发出浓度为10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、80μg/ml的医用臭氧,打开盖子20分钟后送培养。2.不同浓度医用臭氧对大鼠周围神经的作用部分wistar大鼠30只,随机分为6组（n=5）。医用臭氧组:臭氧10、臭氧30、臭氧50、臭氧80组分别注射浓度为10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、80μg/ml的医用臭氧1ml,纯氧组注射医用纯氧1ml,对照组组仅行穿刺不注射;穿刺注射部位在大鼠右后肢臀大肌与股二头肌长头外侧缘交界处。术后观察大鼠行为学改变及大体情况变化,术后1d、1w、3w分别测大鼠后肢足迹并计算坐骨神经功能指数（SFI）,术后3周,麻醉下暴露其右侧坐骨神经,采用近神经刺激法检测大鼠坐骨神经的神经传导速度、潜伏期及最大波幅;过量3%戊巴比妥钠麻醉处死大鼠,切取其坐骨神经制成切片行光镜检查,切取同侧小腿三头肌测湿重。3.不同浓度医用臭氧对大鼠骨骼肌的作用部分30只大鼠随机分5组（n=6）,医用臭氧组:臭氧10、臭氧30、臭氧50、臭氧80组分别注射浓度为10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、80μg/ml的医用臭氧1ml,对照组仅行穿刺不注射;穿刺注射部位在右侧臀大肌,注射的气体均为1ml。注射后10min、30min及3周后分别对臭氧注射点取活检在光镜下行病理学检查。4.统计学分析所得数据用SPSS13.0软件行统计学处理,对医用臭氧细菌培养实验数据进行x²检验,检验水准为α=0.05,P≤0.05表示差异有统计学意义或有显著性差异。医用臭氧对大鼠周围神经、骨骼肌作用等的实验数据进行完全随机资料多组均数间比较的one-way ANOVA分析,检验水准为α=0.05,P≤0.05表示差异有统计学意义或有显著性差异;对SFI采用General Linear Model中的repeated measures进行分析。结果以均数士标准差（（?）±s）表示。结果1.医用臭氧细菌培养实验部分（1）关节腔灌洗液培养,对照组及臭氧80R组均无菌落出现,臭氧10R、臭氧30R及臭氧50R组中各有一个血琼脂培养皿出现菌落,菌落的数量随医用臭氧浓度的增高而明显减少;（2）所有医用臭氧气体直接培养的血琼脂培养皿中,均无菌落出现。2.不同浓度医用臭氧对大鼠周围神经的作用部分各组大鼠均未出现明显行为学改变,注射部位无红肿、流脓,足趾无溃疡、坏死;数据结果采用SPSS13.0统计软件进行分析,其中重复测量数据使用GeneralLinear Model中的repeated measures进行分析,其它数据使用one-way ANOVA统计分析,各组大鼠SFI各个时间段间比较均无显著性差异（P＜0.05）;神经传导速度、潜伏期经过两两间均数比较,无显著性差异;最大波幅、小腿三头肌湿重各组间比较无显著性差异（P＜0.05）:光镜下各组组织形态学表现无明显差异。3.不同浓度医用臭氧对大鼠骨骼肌的作用部分与对照组比较,光镜下显示臭氧30、臭氧50及臭氧80三组注射臭氧后10min注射点见肌细胞肿胀,肌细胞边界不清,部分肌细胞坏死溶解,空泡变性;30min后在肌细胞坏死溶解的基础上出现了肌细胞间隙和血管内炎症细胞浸润;3周后切片显示肌细胞明显萎缩,较多纤维组织增生,部分伴有玻璃样变,而臭氧10组与对照组间比较没有明显差异。结论1.医用臭氧中可能含有细菌,医用臭氧注射进机体后其杀菌能力可能减弱甚至消失,在应用医用臭氧治疗时,应在臭氧发生器连接处加一次性针头滤器以防止感染。2.浓度为10μg/ml～80μg/ml的医用臭氧局部注射,对大鼠的行为学无明显影响,对大鼠坐骨神经的结构、功能无明显影响。提示在大鼠周围神经周围注射浓度为10～80μg/ml的医用臭氧是安全的。3.浓度为30μg/ml、50μg/ml、80μg/ml的臭氧肌肉注射后会产生程度相当的肌细胞损害,3周后纤维组织损伤修复,浓度为10μg/ml的臭氧对肌肉组织没有明显损害作用。