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本文主要包括两个方面的研究。第一部分：研究结核分枝杆菌表型与基因型耐药之间的关联。第二部分：尝试建立一种基于微流控的竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应技术检测结核分枝杆菌耐药相关基因突变位点，并将该法用于结核分枝杆菌利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因突变筛查。 第一部分 目的： 试图通过研究结核分枝杆菌表型耐药与基因型耐药之间的潜在联系，寻找对临床结核分枝杆菌耐药有诊断意义的突变位点。 方法： 我们对226份临床痰标本通过BECTECT M MGITT M960药敏试验进行利福平（Rifampin,RFP）、异烟肼(Isoniazid,INH)、链霉素(Streptomycin,SM)和乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)耐药表型实验，并对耐药相关基因进行DNA测序。 结果： 本研究总共收集了226份确诊为结核病人的痰液标本，这226份标本的MGITTM960药敏试验结果显示，其总耐药率为27.9%（63/226），MDR耐药率为17.7%（40/226），其中RFP、INH、SM、EMB的耐药率分别为13.3%（30/226）、23.5%（53/226）、16.8%（38/226）、7.1%（16/226）。对已知四药MGITT M960药敏试验结果的菌株针对耐药相关基因进行测序，发现在RFP表型耐药的菌株中， rpoB的突变率为94.7%，是利福平耐药的主要机制。rpo B基因突变中以526和531密码子突变最常见。对于INH，耐药株中katG基因的突变率为61.1%，以315密码子突变为主,占耐药突变的80%。对于SM，rpsL和rrs的突变是SM耐药的主要分子机制，rpsL的突变率为85.7%。对于耐EM B的菌株中e mb B的突变率为80%，以306密码子为主突变率达60%。 结论： 通过分析结核分枝杆菌耐RFP、INH、SM、EMB相关基因的突变位点和频率，认为rpoB526、531，katG315，rpsL43、88及embB306等位点突变能作为判断结核分枝杆菌耐药性的分子标记，为更现代化的分子生物学诊断技术应用于结核耐药检测提供理论参考。 第二部分 目的： 尝试建立一种基于微流控的竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive allele specific PCR，KASP）检测结核耐药基因突变位点的方法，并将该法应用于结核分枝杆菌耐利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇相关基因突变筛查。 方法： 利用等位基因特异性聚合酶链式反应和荧光能量共振转移原理，针对每个突变位点设计两条等位基因特异性正向引物和一条通用反向引物，其中两条特异性上游引物3’端最末尾碱基分别为野生或突变位点，5’端带有一段FAM或HEX的荧光标签序列，通过正向引物3’端最末尾碱基对特定位点进行识别。我们设计了一款微流控芯片，构建了一种快速筛查结核分枝杆菌耐药基因的方法，该方法结合了微流控芯片与KASP体系的优势，我们将这一方法应用到异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素耐药基因的突变筛查。 结果： 该体系具有高特异性和灵敏度，检测限达10cop ies/反应，而且对不均一耐药样本可在野生背景中检出1%的突变基因。69株菌株突变筛查结果表明，比较KASP和DN A测序两种方法对69株菌株的突变筛查结果发现，两者的一致性达100%。 结论： 基于微流控的KASP法检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因突变位点，具有快捷、高效、实用及低成本的特点。