论文部分内容阅读
脱氢乙酸钠(Sodium dehydroacetate,DHA-S)是一种常见的食品、饲料防腐添加剂,对引起腐败变质的细菌、酵母菌、霉菌等均有较好的抑制作用。资料报道较大剂量DHA-S给予大鼠、家兔,能使凝血指标如凝血酶原时间(Prothrombin time,PT)及活化部分凝血活酶时间(Activated partial thromboplastin time,APTT)延长,能引起动物不同脏器出现。DHA-S致大鼠凝血障碍与对VK环氧化物还原酶(Vitamin K 2,3-epoxide reductase,VKOR)的抑制有关。VKOR 酶有 VK 2,3-环氧化物还原酶复合物1(VKORC1)和VK 2,3-环氧化物还原酶复合物1-样蛋白1(VKORC1L1)两种亚型。VKORC1在大鼠肝脏中占多数;VKORC1L1主要在肝外组织中。DHA-S作为饲料防霉剂使用对家禽凝血功能可能的影响,目前未见有报道。本文通过DHA-S经口给予肉鸡后,检测凝血指标PT、APTT及血清中VK、FIX的含量,应用HPLC法测定DHA-S在血液及组织中的分布,评价DHA-S对肉鸡凝血功能的影响;通过Western Blot及免疫组化方法分析组织中VKORC1和VKORC1L1的表达水平,探讨DHA-S对肉鸡凝血功能影响的VKOR机制。为DHA-S在动物饲料中的合理使用及应用安全性评价积累资料。黄羽肉鸡分别经口给予100、150、200 mg/kgb.w DHA-S,另设正常对照组。100、150 mg/kg连续给予7 d;200 mg/kg组连续给予3 d。分别于DHA-S给予后不同时间采集血液、肝和肺等组织样品。凝血仪检测血液样品的PT、APTT值,ELISA法检测血清中PT、VK、FIX含量。HPLC检测血液及肝、肺等组织中DHA-S的含量;Western Blot及免疫组化方法分析组织中VKORC1和VKORC1L1的表达水平。并对血液中DHA-S浓度与PT、APTT,及与组织中的VKORC1和VKORC1L1的表达进行了相关性分析。结果表明100 mg/kg DHA-S给予肉鸡后,PT、APTT值虽有变化,但差异不显著。150 mg/kg DHA-S一次给予4h、8h或连续给予5d、7d后,鸡的PT、APTT值均显著延长(P<0.05),母鸡分别约为对照组的1.10～1.30、1.15～1.35倍;公鸡约为1.10～1.30、1.25～1.45倍。鸡血清中VK含量在不同的时间点均显著降低(P<0.05)。母鸡和公鸡血清中FIX仅在一次给予4 h、8 h时出现显著的降低(P<0.05)。200 mg/kg DHA-S一次给予4 h、8 h、16 h、24 h或连续给予2d、3d后,母鸡和公鸡PT、APTT值均显著延长(P<0.05)。鸡血清中VK含量均显著降低(P<0.05)。母鸡或公鸡血清中FIX均有不同程度的显著降低(P<0.05)。HPLC法检测鸡血清及组织中DHA-S含量,结果表明150 mg/kg及200 mg/kg一次给予DHA-S后,4h、8h时血清中药物浓度显著高于16h、24h(P<0.05)。一次给药后8 h不同组织DHA-S出现峰浓度。母鸡肝脏、肺脏中的药物浓度在同一时间点显著高于公鸡(P<0.05)。Western Blot方法检测组织中VKORC1和VKORC1L1的蛋白水平,结果表明DHA-S 150 mg/kg单次给药或200 mg/kg连续给药后,肉鸡肝脏、肺脏中VKORC1和VKORC1L1的表达显著降低(P<0.05),约为对照组的一半。卵巢组织中VKORC1L1蛋白也显著降低(P<0.05),约为对照组的1/2。免疫组化检测结果,鸡肝脏、肺脏、卵巢及睾丸组织中的VKORC1蛋白表达量与对照组相比均明显下降。相关性分析结果表明,血清中DHA-S浓度与PT、APTT呈正相关,公鸡的DHA-S浓度与PT、APTT相关系数(0.82;0.86)高于母鸡(0.69;0.31),且具有显著性差异(P<0.05);血清中DHA-S浓度与组织中VKORC1和VKORC1L1呈负相关,肝脏中DHA-S浓度与VKORC1和VKORC1L1表达的相关性高于肺脏。综上所述,较高剂量DHA-S能引起黄羽肉鸡凝血指标PT、APTT值延长,血清中VK、FIX含量下降,存在着引起肉鸡凝血障碍的风险。DHA-S在母鸡组织中药物浓度高于公鸡。DHA-S对鸡组织中VKORC1和VKORC1L1明显抑制,是DHA-S致肉鸡凝血功能障碍的主要原因之一。研究结果可为DHA-S在临床的合理应用及对肉鸡凝血功能影响的作用机制研究提供理论依据。