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研究背景与目的
多种恶性肿瘤中均出现CHD1L基因扩增及过表达，CHD1L在肿瘤细胞侵袭、转移中发挥重要作用，与肿瘤的恶性进展、分期及不良预后密切相关。以CHD1L为靶标阻断肿瘤恶性进展的治疗有潜在临床应用前景，其前提是全面解读CHD1L的作用及其分子调控机制。前期研究中通过CHD1LChIP-Sequencing实验结果分析，我们发现CHD1L与ZKSCAN3基因转录启始位点上游区段存在潜在结合位点。ZKSCAN3是含有KRAB和SCAN结构域的锌指转录因子家族成员，可负性调控多个与自噬体及溶酶体生成相关基因，在自噬的转录抑制中发挥关键作用。CHD1L与ZKSCAN3间的潜在结合提示CHD1L可能与自噬调控有关。
自噬(macroautophagy)是细胞在自噬相关基因的调控下利用溶酶体降解衰老、变性蛋白及受损细胞器、对细胞内物质进行周转利用的重要过程，可维持细胞内稳态。自噬在肿瘤发生发展中具有双重作用，一方面，可通过清除多余及功能异常的线粒体，减轻氧化应激和DNA损伤而发挥肿瘤抑制作用；另一方面可减轻代谢应激、促进肿瘤细胞侵袭转移。研究显示ZKSCAN3高表达于结直肠癌、多发性骨髓瘤及前列腺癌等多种肿瘤中，与增殖、侵袭等细胞表型有关，然而，也有研究报道ZKSCAN3在肿瘤中低表达，提示ZKSCAN3的功能与肿瘤的类别、肿瘤细胞复杂的生物学遗传背景等有关。CHD1L与ZKSCAN3的潜在结合提示CHD1L可能通过ZKSCAN3参与细胞自噬的调控。阐明两者间的作用有助于理解CHD1L促肿瘤恶性进展的作用及分子机制。
方法
ChIP-PCR及ChIP-qPCR技术检测CHD1L与潜在ZKSCAN3靶序列结合；脂质体转染构建瞬时CHD1L过表达或下调ZKSCAN3、Paxillin、ATG5细胞株;免疫共沉淀技术检测蛋白与蛋白的结合;免疫印迹法检测相关蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测相关基因的转录水平;透射电子显微镜观察细胞内自噬体或自噬溶酶体情况;免疫荧光实验检测LC3斑点的形成以判断自噬水平，检测LAMP1斑点形成以判断溶酶体的生成；通过Paxillin及Zyxin荧光双标记判断成熟黏着斑的解聚状态;Transwell及细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。
结果
第一部分CHD1L靶向性抑制ZKSCAN3转录，增强肝癌细胞自噬
1、CHD1L对ZKSCAN3转录的影响
ChIP-PCR及ChIP-qPCR检测证明CHD1L与ZKSCAN3的结合位点位于ZKSCAN3TSS上游-4692bp～-4341bp区段。过表达CHD1L可明显下调肝癌细胞ZKSCAN3mRNA及蛋白表达，采用siRNA干扰方法下调肝癌Huh7及HepG2细胞中CHD1L表达、CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除肝癌QGY-7703细胞中CHD1L后，ZKSCAN3mRNA及蛋白表达均显著上调。细胞免疫荧光染色显示瞬时转染GFP-CHD1L表达载体后CHD1L强阳性表达细胞中ZKSCAN3为弱表达，CHD1L弱表达细胞则有较强的ZKSCAN3表达，定位于胞核。人肝癌及癌旁配对样本免疫印迹检测结果显示CHD1L与ZKSCAN3的表达互为反向，qPCR结果进一步证实敲除CHD1L后ZKSCAN3下游自噬相关基因表达均有相应的下调，表明CHD1L可靶向抑制ZKSCAN3的转录，解除ZKSCAN3对其下游自噬相关基因的抑制作用。
2、CHD1L促肝癌细胞自噬作用
进一步实验结果显示过表达CHD1L可增加自噬标记分子LC3-Ⅱ蛋白转化，而敲减/敲除CHD1L后，LC3-Ⅱ蛋白转化减少。为明确LC3-Ⅱ蛋白水平的改变是因自噬-溶酶体融合受阻还是自噬体形成增加所致，我们用自噬抑制剂BafA1阻断自噬-溶酶体融合后观察CHD1L对LC3-Ⅱ蛋白转化的影响，结果显示BafA1处理进一步增加CHD1L过表达组LC3-Ⅱ的转化，且BafA1处理无法回调敲减或敲除CHD1L后细胞内LC3-Ⅱ的转化。同样，在不同时间点用饥饿法诱导细胞强自噬同时敲除CHD1L后LC3-Ⅱ的转化减少，P62蛋白水平升高，细胞经BafA1及CQ处理后均无法回调敲除CHD1L所致的LC3-Ⅱ转化减少。LC3B免疫荧光方法检测结果显示与对照组相比，敲除CHD1L后细胞内自噬体数量明显减少，正常或饥饿状态下给予BafA1处理均无法逆转敲除CHD1L所致的自噬体减少。透射电子显微镜显示，与对照组相比敲除CHD1L后肝癌细胞内自噬体/自噬溶酶体数量明显减少，提示CHD1L在自噬体形成中发挥重要作用。
3、CHD1L通过抑制ZKSCAN3的转录促进肝癌细胞自噬
在诱导性敲除CHD1L的肝癌细胞(7703-CHD1L-iKO)中，用siRNA方法下调ZKSCAN3，结果显示ZKSCAN3的敲减可回调自噬标记物LC3-Ⅱ蛋白水平。同样地，LC3B的免疫荧光结果显示，不同条件下，相对于Scramble组，敲减ZKSCAN3后自噬泡聚集明显增多，在BafA1作用下更为明显，说明下调ZKSCAN3逆转了敲除CHD1L所致的自噬抑制，表明ZKSCAN3介导了CHD1L促自噬体形成作用。
第二部分Paxillin的自噬性降解促进肝癌细胞迁移
为进一步探讨自噬在CHD1L促细胞迁移中的作用，我们通过Transwell及划痕实验观察阻断自噬对CHD1L所致的细胞迁移的影响。结果显示敲除CHD1L可显著抑制QGY-7703细胞的迁移，但在用BafA1或CQ阻断自噬后，敲除CHD1L对QGY-7703细胞迁移未见明显影响，表明CHD1L所致的细胞迁移依赖于自噬。已知自噬体标记物LC3可连接黏着斑(Focal aderhesion, FA)关键蛋白Paxillin，通过激发Paxillin的自噬性降解、加速黏着斑解聚而促小鼠乳腺癌细胞迁移。我们用免疫共沉淀实验检测肝癌细胞中是否同样存在Paxillin-LC3B互作，结果显示QGY-7703细胞中内源性Paxillin与LC3B有结合，敲除CHD1L出现明显的Paxillin堆积，外源性添加CQ及BafA1或应用siRNA干扰自噬关键分子ATG5后，敲除CHD1L，与对照组相比Paxillin蛋白水平均未产生明显改变；表明CHD1L通过自噬促Paxillin降解。回调实验显示在敲除CHD1L的细胞中下调ZKSCAN3可减少Paxillin累积，提示ZKSCAN3介导了CHD1L促Paxillin自噬性降解过程。Paxillin/Zyxin免疫荧光双标显示，敲除CHD1L后肝癌细胞中成熟FA数量明显增加、体积增大，提示FA解聚减缓。为明确Paxillin的堆积所致的FA解聚减缓是否影响了肝癌细胞的迁移，我们采用siRNA干扰技术下调Paxillin表达，免疫荧光双标显示下调Paxillin后FA的数量减少、体积缩小。Transwell及划痕实验结果显示随着Paxillin表达下调，细胞迁移能力得以回调。上述结果表明，CHD1L可通过促进Paxillin的自噬性降解进加快FA的解聚，从而促进肿瘤细胞的迁移。
结论
1.CHD1L可靶向结合ZKSCAN3，结合区段位于ZKSCAN3转录启始位点(TSS)上游-4692～-4341bp之间。
2.CHD1抑制ZKSCAN3的转录，阻断ZKSCAN3对下游自噬相关基因的转录抑制作用，进而促进肝癌细胞的自噬。
3.CHD1L介导的自噬促进Paxillin的自噬性降解及FA的动力学变化，从而提升肿瘤细胞的迁移能力。
多种恶性肿瘤中均出现CHD1L基因扩增及过表达，CHD1L在肿瘤细胞侵袭、转移中发挥重要作用，与肿瘤的恶性进展、分期及不良预后密切相关。以CHD1L为靶标阻断肿瘤恶性进展的治疗有潜在临床应用前景，其前提是全面解读CHD1L的作用及其分子调控机制。前期研究中通过CHD1LChIP-Sequencing实验结果分析，我们发现CHD1L与ZKSCAN3基因转录启始位点上游区段存在潜在结合位点。ZKSCAN3是含有KRAB和SCAN结构域的锌指转录因子家族成员，可负性调控多个与自噬体及溶酶体生成相关基因，在自噬的转录抑制中发挥关键作用。CHD1L与ZKSCAN3间的潜在结合提示CHD1L可能与自噬调控有关。
自噬(macroautophagy)是细胞在自噬相关基因的调控下利用溶酶体降解衰老、变性蛋白及受损细胞器、对细胞内物质进行周转利用的重要过程，可维持细胞内稳态。自噬在肿瘤发生发展中具有双重作用，一方面，可通过清除多余及功能异常的线粒体，减轻氧化应激和DNA损伤而发挥肿瘤抑制作用；另一方面可减轻代谢应激、促进肿瘤细胞侵袭转移。研究显示ZKSCAN3高表达于结直肠癌、多发性骨髓瘤及前列腺癌等多种肿瘤中，与增殖、侵袭等细胞表型有关，然而，也有研究报道ZKSCAN3在肿瘤中低表达，提示ZKSCAN3的功能与肿瘤的类别、肿瘤细胞复杂的生物学遗传背景等有关。CHD1L与ZKSCAN3的潜在结合提示CHD1L可能通过ZKSCAN3参与细胞自噬的调控。阐明两者间的作用有助于理解CHD1L促肿瘤恶性进展的作用及分子机制。
方法
ChIP-PCR及ChIP-qPCR技术检测CHD1L与潜在ZKSCAN3靶序列结合；脂质体转染构建瞬时CHD1L过表达或下调ZKSCAN3、Paxillin、ATG5细胞株;免疫共沉淀技术检测蛋白与蛋白的结合;免疫印迹法检测相关蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测相关基因的转录水平;透射电子显微镜观察细胞内自噬体或自噬溶酶体情况;免疫荧光实验检测LC3斑点的形成以判断自噬水平，检测LAMP1斑点形成以判断溶酶体的生成；通过Paxillin及Zyxin荧光双标记判断成熟黏着斑的解聚状态;Transwell及细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。
结果
第一部分CHD1L靶向性抑制ZKSCAN3转录，增强肝癌细胞自噬
1、CHD1L对ZKSCAN3转录的影响
ChIP-PCR及ChIP-qPCR检测证明CHD1L与ZKSCAN3的结合位点位于ZKSCAN3TSS上游-4692bp～-4341bp区段。过表达CHD1L可明显下调肝癌细胞ZKSCAN3mRNA及蛋白表达，采用siRNA干扰方法下调肝癌Huh7及HepG2细胞中CHD1L表达、CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除肝癌QGY-7703细胞中CHD1L后，ZKSCAN3mRNA及蛋白表达均显著上调。细胞免疫荧光染色显示瞬时转染GFP-CHD1L表达载体后CHD1L强阳性表达细胞中ZKSCAN3为弱表达，CHD1L弱表达细胞则有较强的ZKSCAN3表达，定位于胞核。人肝癌及癌旁配对样本免疫印迹检测结果显示CHD1L与ZKSCAN3的表达互为反向，qPCR结果进一步证实敲除CHD1L后ZKSCAN3下游自噬相关基因表达均有相应的下调，表明CHD1L可靶向抑制ZKSCAN3的转录，解除ZKSCAN3对其下游自噬相关基因的抑制作用。
2、CHD1L促肝癌细胞自噬作用
进一步实验结果显示过表达CHD1L可增加自噬标记分子LC3-Ⅱ蛋白转化，而敲减/敲除CHD1L后，LC3-Ⅱ蛋白转化减少。为明确LC3-Ⅱ蛋白水平的改变是因自噬-溶酶体融合受阻还是自噬体形成增加所致，我们用自噬抑制剂BafA1阻断自噬-溶酶体融合后观察CHD1L对LC3-Ⅱ蛋白转化的影响，结果显示BafA1处理进一步增加CHD1L过表达组LC3-Ⅱ的转化，且BafA1处理无法回调敲减或敲除CHD1L后细胞内LC3-Ⅱ的转化。同样，在不同时间点用饥饿法诱导细胞强自噬同时敲除CHD1L后LC3-Ⅱ的转化减少，P62蛋白水平升高，细胞经BafA1及CQ处理后均无法回调敲除CHD1L所致的LC3-Ⅱ转化减少。LC3B免疫荧光方法检测结果显示与对照组相比，敲除CHD1L后细胞内自噬体数量明显减少，正常或饥饿状态下给予BafA1处理均无法逆转敲除CHD1L所致的自噬体减少。透射电子显微镜显示，与对照组相比敲除CHD1L后肝癌细胞内自噬体/自噬溶酶体数量明显减少，提示CHD1L在自噬体形成中发挥重要作用。
3、CHD1L通过抑制ZKSCAN3的转录促进肝癌细胞自噬
在诱导性敲除CHD1L的肝癌细胞(7703-CHD1L-iKO)中，用siRNA方法下调ZKSCAN3，结果显示ZKSCAN3的敲减可回调自噬标记物LC3-Ⅱ蛋白水平。同样地，LC3B的免疫荧光结果显示，不同条件下，相对于Scramble组，敲减ZKSCAN3后自噬泡聚集明显增多，在BafA1作用下更为明显，说明下调ZKSCAN3逆转了敲除CHD1L所致的自噬抑制，表明ZKSCAN3介导了CHD1L促自噬体形成作用。
第二部分Paxillin的自噬性降解促进肝癌细胞迁移
为进一步探讨自噬在CHD1L促细胞迁移中的作用，我们通过Transwell及划痕实验观察阻断自噬对CHD1L所致的细胞迁移的影响。结果显示敲除CHD1L可显著抑制QGY-7703细胞的迁移，但在用BafA1或CQ阻断自噬后，敲除CHD1L对QGY-7703细胞迁移未见明显影响，表明CHD1L所致的细胞迁移依赖于自噬。已知自噬体标记物LC3可连接黏着斑(Focal aderhesion, FA)关键蛋白Paxillin，通过激发Paxillin的自噬性降解、加速黏着斑解聚而促小鼠乳腺癌细胞迁移。我们用免疫共沉淀实验检测肝癌细胞中是否同样存在Paxillin-LC3B互作，结果显示QGY-7703细胞中内源性Paxillin与LC3B有结合，敲除CHD1L出现明显的Paxillin堆积，外源性添加CQ及BafA1或应用siRNA干扰自噬关键分子ATG5后，敲除CHD1L，与对照组相比Paxillin蛋白水平均未产生明显改变；表明CHD1L通过自噬促Paxillin降解。回调实验显示在敲除CHD1L的细胞中下调ZKSCAN3可减少Paxillin累积，提示ZKSCAN3介导了CHD1L促Paxillin自噬性降解过程。Paxillin/Zyxin免疫荧光双标显示，敲除CHD1L后肝癌细胞中成熟FA数量明显增加、体积增大，提示FA解聚减缓。为明确Paxillin的堆积所致的FA解聚减缓是否影响了肝癌细胞的迁移，我们采用siRNA干扰技术下调Paxillin表达，免疫荧光双标显示下调Paxillin后FA的数量减少、体积缩小。Transwell及划痕实验结果显示随着Paxillin表达下调，细胞迁移能力得以回调。上述结果表明，CHD1L可通过促进Paxillin的自噬性降解进加快FA的解聚，从而促进肿瘤细胞的迁移。
结论
1.CHD1L可靶向结合ZKSCAN3，结合区段位于ZKSCAN3转录启始位点(TSS)上游-4692～-4341bp之间。
2.CHD1抑制ZKSCAN3的转录，阻断ZKSCAN3对下游自噬相关基因的转录抑制作用，进而促进肝癌细胞的自噬。
3.CHD1L介导的自噬促进Paxillin的自噬性降解及FA的动力学变化，从而提升肿瘤细胞的迁移能力。