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研究目的：建立抑郁型乳腺癌4T1荷瘤动物模型，利用分子影像学技术-生物自发荧光成像系统，动态观察乳腺癌荷瘤内部结构的变化特征，对比中药有效方剂疏肝健脾方干预前后，肿瘤内部新生血管、淋巴管的形态、炎性细胞浸润及肿瘤细胞的坏死、凋亡等的动态变化，尤其在肿瘤体积变化不明显的情况下，是否存在其内部的血管、淋巴管及坏死治疗差异。在整体水平揭示疏肝健脾方防治乳腺癌的效应特点，为建立中医药防治肿瘤在整体水平评价体系奠定基础。通过抑郁型乳腺癌4T1荷瘤动物模型，利用分子影像学技术-Vectra多光谱切片流式系统，动态揭示肿瘤免疫微环境相关的细胞活性及细胞因子分泌水平变化。对免疫微环境中的发挥免疫监视作用的CD4+、CD8+效应性T细胞、NK细胞、DC细胞和发挥免疫抑制作用的调节性T细胞、髓系抑制细胞（MDSCs）等生物学活性进行检测；同时检测杀伤肿瘤细胞的因子TNF-α、和肿瘤免疫抑制因子TGF-β的水平及其对免疫效应T细胞的抑制机制进行探讨。
研究方法：建模：4T1乳腺癌动物模型建立：将4T1-fluc乳腺癌细胞接种于小鼠右侧第二对乳腺脂肪垫内，每只小鼠接种2.5×105个乳腺癌细胞。抑郁型乳腺癌动物模型建立：除正常对照组外，接种4T1-fluc乳腺癌细胞次日开始以周为单位每天对抑郁障碍小鼠予以7种不同慢性温和不可预知性应激刺激（包括热刺激、冷刺激、进食、禁水、昼夜颠倒、水平震荡、倾斜），每天随机安排一种刺激方式，共28d。分组：正常对照组（Normalcontrol，NC)：常规饲养；单纯抑郁组(Puredepression，PD）：单纯建立抑郁障碍模型；单纯荷瘤组（Puretumor，PT)：单纯接种4T1乳腺癌细胞；抑郁荷瘤组(Depressiontumor，DT)：接种乳腺癌细胞后建立抑郁障碍模型；疏肝健脾方组（Shu-Gan-Jian-Pi，SGJP）：接种乳腺癌细胞后建立抑郁障碍模型，给予SGJP中药干预；盐酸吉西他滨组（Gemcitabinehydrochloride，GEM）：接种乳腺癌细胞后建立抑郁障碍模型，给予GEM干预；GJP+GEM组：接种乳腺癌细胞后建立抑郁障碍模型，给予SGJP中药和GEM干预；三七总皂苷组（Panaxnotoginsengsaponins，PNS)，接种乳腺癌细胞后建立抑郁障碍模型，给予PNS，按照150mg/kg给药；PNS+GEM组：接种乳腺癌细胞后建立抑郁障碍模型，给予PNS中药单体和GEM干预。
研究结果
1.成功建立了病证结合的抑郁荷瘤模型。
蔗糖水实验：在实验干预前与实验中通过测量小鼠消耗蔗糖水的饮用量，观察到单纯抑郁组和抑郁荷瘤组小鼠的蔗糖水消耗量随着造模的时间增长逐渐降低，且抑郁荷瘤组消耗的蔗糖水饮用量最少。考虑慢性应激性刺激对小鼠生活质量有影响，说明抑郁荷瘤模型建立成功。旷场试验：在实验慢性应激性刺激及药物干预第21天后对小鼠进行旷场实验检测，结果显示：不论是从小鼠活动的热图还是小鼠在旷场箱内水平移动的格数和垂直移动的次数，单纯抑郁组和抑郁荷瘤组比正常对照组在水平移动的格数和垂直的次数上均低，且抑郁荷瘤组最低，说明造模成功。给药组与抑郁荷瘤组相比，给药组的热图、移动格数与垂直次数均大于抑郁荷瘤组，其中单纯中药、中药化疗组的热图、移动格数和垂直次数大于抑郁荷瘤组（P＜0.05）。体重变化：在造模前（第0天）和造模中（第6天、第9天、第12天、第15天、第18天、第21天）给各组小鼠称重，并记录。经分析数据呈正态分布（P＞0.05），无统计学差异。所有给予慢性不可预知性刺激的小鼠体重都低于正常对照组和单纯荷瘤组，且抑郁荷瘤组体重最低。在不同的药物的干预方式下，单纯单体和单体化疗组的体重高于单纯中药和中药化疗组，单纯中药组和中药化疗组高于抑郁荷瘤组。
2.疏肝健脾中药干预后对抑郁荷瘤小鼠的实体瘤的体积、瘤重和抑瘤率的影响
在实验第6、9、12、15、18、21天，通过对荷瘤小鼠的实体瘤体积进行测量：抑郁荷瘤组随着实验天数增长实体瘤的体积亦呈增长趋势且高于其他实验组，说明情志因素影像肿瘤的大小；给予不同药物干预后，单纯中药大于单纯荷瘤组且小于单纯单体，单纯化疗组小于单纯中药组，单纯化疗组大于单体化疗和中药化疗，单体化疗大于中药化疗，中药化疗组实体瘤体积最小。在实验21天后取材，得到各组荷瘤小鼠的瘤重，其中抑郁荷瘤组最重（1.29±0.31）且大于单纯荷瘤组（1.25±0.39）；在药物干预后，中药化疗组瘤重最轻（0.25±0.16）且＞单纯单体组＞单纯中药组＞单纯化疗组＞单体化疗，方差分析P＜0.01,各组有显著差异。根据实体瘤重得到每组荷瘤小鼠的抑瘤率，单纯中药、单纯化疗、中药化疗、单纯单体和单体化疗的抑瘤率分别为：22%、66%、81%、6%、71%，中药化疗组的抑瘤率最高。说明药物干预后，疏肝健脾方加化疗药效果最明显，有抑制肿瘤的生长作用。
3.采用分子影像技术评价乳腺癌荷瘤小鼠的生长情况
在实验第6、9、12、15、18、21天，通过小动物体成像测量荷瘤小鼠体内的荧光值，荧光值代表着肿瘤细胞的活性。在实验第6、9、12、15、18天的荷瘤小鼠的荧光值逐渐增长，但在21天时，各组荷瘤的荧光值在降低。在实验过程中，抑郁荷瘤组的荧光值最高。模型对照组中，抑郁荷瘤＞单纯荷瘤；考虑到慢性应激性刺激过多途径刺激肿瘤的增长，促进肿瘤细胞的活性。第18天时，各组荧光值达到分值，结果：抑郁荷瘤＞单纯单体＞单纯中药＞单纯荷瘤＞单纯化疗＞单体化疗＞中药化疗。但在21天后，各组荷瘤小鼠体内的荧光值都有所下降，说明在试验后期，肿瘤细胞活性降低，肿瘤内部结构发生了变化。
4.动物活体成像系统评价肿瘤血管生成-激发荧光探针在体内的代谢研究结果
在实验21天后，通过小动物活体成像系统中的激发荧光成像技术探测肿瘤内部新生血管发生变化，荧光值结果显示：模型对照组中，抑郁荷瘤>单纯荷瘤；给药干预后，单纯中药＞单纯化疗＞中药药化疗＞单纯单体，实验说明中药单体三七总皂苷有抑制肿瘤血管新生的作用且效果最好。
5.疏肝健脾中药对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤微环境的干预作用观察
通过普通流式系统，检测小鼠脾脏CD3+CD4+CD8+阳性比较中，正常对照组表达量最高，高于单纯抑郁和单纯荷瘤组；抑郁荷瘤组表达量最低，抑郁荷瘤组小于单纯荷瘤组；在给药组相比较，中药化疗＜单纯单体＜单体化疗＜单纯化疗＜单纯中药，说明抑郁障碍状态下免疫细胞状态低下，机体处于免疫抑制状态，有可能会促进肿瘤进展、转移。但在经过中药和化疗药的治疗后，机体的免疫力有所增加。检测髓系抑制细胞MDSC在正常对照组表达数值最低（2.72±0.52），单纯抑郁组（5.47±1.50）>正常对照组，抑郁荷瘤组中脾脏表达的MDSC（60.51±1.23）最高，高于单纯荷瘤组；五组药物干预组与抑郁荷瘤组相比较，MDSC的表达量均有下降，抑郁荷瘤＞单纯单体＞单纯中药＞单体化疗＞单纯化疗＞中药化疗。说明抑郁障碍可能使髓系抑制细胞MDSC表达升高，化疗药健择可以在缓解或抑制MDSC激增的同时，调节机体免疫力。疏肝健脾方很可能通过疏肝解郁、调畅情绪来提高机体细胞免疫水平，在抗肿瘤免疫监视中可以有效的缓解免疫抑制状态，对脾脏中MDSC的含量具有一定的下调作用，延缓疾病进展。
通过多光谱切片流式-Vectra分析系统测得MDSC、CD4+、CD8+表达（定性、定位），不同颜色的荧光值代表不同检测标记，蓝色代表CD4+的表达，红色为CD8+表达，绿色代表MDSC的表达的表达，蓝色为细胞核染。正常对照组CD4+、CD8+表达的最多蓝色分布最多，抑郁荷瘤组表达的最少，而在MDSC的表达中抑郁荷瘤组绿色分布最多，正常对照组最少。说明与普通流式检测的结果一致，但多光谱流式更能从定性、定位上说明肿瘤免疫微环境发生的变化。
6.肿瘤微环境细胞因子检测结果—TNF-α、TGF-β含量
通过测量小鼠外周血中TNF-α含量显示：正常对照组＞单纯荷瘤组＞单纯抑郁组＞抑郁荷瘤组，且P＜0.05,有统计学差异；在5组给药治疗组中，中药化疗组＞单纯化疗组＞单纯单体组＞单纯中药组＞单体化疗组＞抑郁荷瘤组，P＜0.05,有统计学差异。说明抑郁荷瘤模型可以通过促进血管新生促进肿瘤的生长，也可以通过抑制T细胞，降低机体的免疫力。药物干预后，中药加化疗药抑制肿瘤生长提高免疫力。
通过测量小鼠外周血中TGF-β含量显示：抑郁荷瘤组＞单纯荷瘤组＞单纯抑郁组＞正常对照组，且P＜0.05,有统计学差异；在5组给药治疗组中，单纯单体组＞单纯中药组＞单纯化疗组>单体化疗组＞中药化疗组＞抑郁荷瘤组，P＜0.05,有统计学差异。TGF-β是介导肿瘤免疫逃逸最有效的免疫抑制分子，可抑制各种免疫细胞在瘤组织中的浸润和增殖。
结论
1.借助肿瘤分子影像学技术对比观察中药复方疏肝健脾方和中药单体三七总皂苷干预作用显示：疏肝健脾方和三七总皂苷在抑制抑郁型乳腺癌的体积大小上虽不明显，但具有抑制肿瘤内部新生血管和淋巴管的浸润的作用。
2.疏肝健脾方联合化疗药物吉西他滨抑制抑郁型乳腺肿瘤效果最为显著，其机制与下调MDSC的表达，上调CD3+CD4+CD8+的表达，增强小鼠机体的免疫力有关。
3.疏肝健脾方联合吉西他滨可以发挥重塑T淋巴细胞亚群功能作用，与促进TNF-α表达，抑制TGF-β分泌有关。
研究方法：建模：4T1乳腺癌动物模型建立：将4T1-fluc乳腺癌细胞接种于小鼠右侧第二对乳腺脂肪垫内，每只小鼠接种2.5×105个乳腺癌细胞。抑郁型乳腺癌动物模型建立：除正常对照组外，接种4T1-fluc乳腺癌细胞次日开始以周为单位每天对抑郁障碍小鼠予以7种不同慢性温和不可预知性应激刺激（包括热刺激、冷刺激、进食、禁水、昼夜颠倒、水平震荡、倾斜），每天随机安排一种刺激方式，共28d。分组：正常对照组（Normalcontrol，NC)：常规饲养；单纯抑郁组(Puredepression，PD）：单纯建立抑郁障碍模型；单纯荷瘤组（Puretumor，PT)：单纯接种4T1乳腺癌细胞；抑郁荷瘤组(Depressiontumor，DT)：接种乳腺癌细胞后建立抑郁障碍模型；疏肝健脾方组（Shu-Gan-Jian-Pi，SGJP）：接种乳腺癌细胞后建立抑郁障碍模型，给予SGJP中药干预；盐酸吉西他滨组（Gemcitabinehydrochloride，GEM）：接种乳腺癌细胞后建立抑郁障碍模型，给予GEM干预；GJP+GEM组：接种乳腺癌细胞后建立抑郁障碍模型，给予SGJP中药和GEM干预；三七总皂苷组（Panaxnotoginsengsaponins，PNS)，接种乳腺癌细胞后建立抑郁障碍模型，给予PNS，按照150mg/kg给药；PNS+GEM组：接种乳腺癌细胞后建立抑郁障碍模型，给予PNS中药单体和GEM干预。
研究结果
1.成功建立了病证结合的抑郁荷瘤模型。
蔗糖水实验：在实验干预前与实验中通过测量小鼠消耗蔗糖水的饮用量，观察到单纯抑郁组和抑郁荷瘤组小鼠的蔗糖水消耗量随着造模的时间增长逐渐降低，且抑郁荷瘤组消耗的蔗糖水饮用量最少。考虑慢性应激性刺激对小鼠生活质量有影响，说明抑郁荷瘤模型建立成功。旷场试验：在实验慢性应激性刺激及药物干预第21天后对小鼠进行旷场实验检测，结果显示：不论是从小鼠活动的热图还是小鼠在旷场箱内水平移动的格数和垂直移动的次数，单纯抑郁组和抑郁荷瘤组比正常对照组在水平移动的格数和垂直的次数上均低，且抑郁荷瘤组最低，说明造模成功。给药组与抑郁荷瘤组相比，给药组的热图、移动格数与垂直次数均大于抑郁荷瘤组，其中单纯中药、中药化疗组的热图、移动格数和垂直次数大于抑郁荷瘤组（P＜0.05）。体重变化：在造模前（第0天）和造模中（第6天、第9天、第12天、第15天、第18天、第21天）给各组小鼠称重，并记录。经分析数据呈正态分布（P＞0.05），无统计学差异。所有给予慢性不可预知性刺激的小鼠体重都低于正常对照组和单纯荷瘤组，且抑郁荷瘤组体重最低。在不同的药物的干预方式下，单纯单体和单体化疗组的体重高于单纯中药和中药化疗组，单纯中药组和中药化疗组高于抑郁荷瘤组。
2.疏肝健脾中药干预后对抑郁荷瘤小鼠的实体瘤的体积、瘤重和抑瘤率的影响
在实验第6、9、12、15、18、21天，通过对荷瘤小鼠的实体瘤体积进行测量：抑郁荷瘤组随着实验天数增长实体瘤的体积亦呈增长趋势且高于其他实验组，说明情志因素影像肿瘤的大小；给予不同药物干预后，单纯中药大于单纯荷瘤组且小于单纯单体，单纯化疗组小于单纯中药组，单纯化疗组大于单体化疗和中药化疗，单体化疗大于中药化疗，中药化疗组实体瘤体积最小。在实验21天后取材，得到各组荷瘤小鼠的瘤重，其中抑郁荷瘤组最重（1.29±0.31）且大于单纯荷瘤组（1.25±0.39）；在药物干预后，中药化疗组瘤重最轻（0.25±0.16）且＞单纯单体组＞单纯中药组＞单纯化疗组＞单体化疗，方差分析P＜0.01,各组有显著差异。根据实体瘤重得到每组荷瘤小鼠的抑瘤率，单纯中药、单纯化疗、中药化疗、单纯单体和单体化疗的抑瘤率分别为：22%、66%、81%、6%、71%，中药化疗组的抑瘤率最高。说明药物干预后，疏肝健脾方加化疗药效果最明显，有抑制肿瘤的生长作用。
3.采用分子影像技术评价乳腺癌荷瘤小鼠的生长情况
在实验第6、9、12、15、18、21天，通过小动物体成像测量荷瘤小鼠体内的荧光值，荧光值代表着肿瘤细胞的活性。在实验第6、9、12、15、18天的荷瘤小鼠的荧光值逐渐增长，但在21天时，各组荷瘤的荧光值在降低。在实验过程中，抑郁荷瘤组的荧光值最高。模型对照组中，抑郁荷瘤＞单纯荷瘤；考虑到慢性应激性刺激过多途径刺激肿瘤的增长，促进肿瘤细胞的活性。第18天时，各组荧光值达到分值，结果：抑郁荷瘤＞单纯单体＞单纯中药＞单纯荷瘤＞单纯化疗＞单体化疗＞中药化疗。但在21天后，各组荷瘤小鼠体内的荧光值都有所下降，说明在试验后期，肿瘤细胞活性降低，肿瘤内部结构发生了变化。
4.动物活体成像系统评价肿瘤血管生成-激发荧光探针在体内的代谢研究结果
在实验21天后，通过小动物活体成像系统中的激发荧光成像技术探测肿瘤内部新生血管发生变化，荧光值结果显示：模型对照组中，抑郁荷瘤>单纯荷瘤；给药干预后，单纯中药＞单纯化疗＞中药药化疗＞单纯单体，实验说明中药单体三七总皂苷有抑制肿瘤血管新生的作用且效果最好。
5.疏肝健脾中药对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤微环境的干预作用观察
通过普通流式系统，检测小鼠脾脏CD3+CD4+CD8+阳性比较中，正常对照组表达量最高，高于单纯抑郁和单纯荷瘤组；抑郁荷瘤组表达量最低，抑郁荷瘤组小于单纯荷瘤组；在给药组相比较，中药化疗＜单纯单体＜单体化疗＜单纯化疗＜单纯中药，说明抑郁障碍状态下免疫细胞状态低下，机体处于免疫抑制状态，有可能会促进肿瘤进展、转移。但在经过中药和化疗药的治疗后，机体的免疫力有所增加。检测髓系抑制细胞MDSC在正常对照组表达数值最低（2.72±0.52），单纯抑郁组（5.47±1.50）>正常对照组，抑郁荷瘤组中脾脏表达的MDSC（60.51±1.23）最高，高于单纯荷瘤组；五组药物干预组与抑郁荷瘤组相比较，MDSC的表达量均有下降，抑郁荷瘤＞单纯单体＞单纯中药＞单体化疗＞单纯化疗＞中药化疗。说明抑郁障碍可能使髓系抑制细胞MDSC表达升高，化疗药健择可以在缓解或抑制MDSC激增的同时，调节机体免疫力。疏肝健脾方很可能通过疏肝解郁、调畅情绪来提高机体细胞免疫水平，在抗肿瘤免疫监视中可以有效的缓解免疫抑制状态，对脾脏中MDSC的含量具有一定的下调作用，延缓疾病进展。
通过多光谱切片流式-Vectra分析系统测得MDSC、CD4+、CD8+表达（定性、定位），不同颜色的荧光值代表不同检测标记，蓝色代表CD4+的表达，红色为CD8+表达，绿色代表MDSC的表达的表达，蓝色为细胞核染。正常对照组CD4+、CD8+表达的最多蓝色分布最多，抑郁荷瘤组表达的最少，而在MDSC的表达中抑郁荷瘤组绿色分布最多，正常对照组最少。说明与普通流式检测的结果一致，但多光谱流式更能从定性、定位上说明肿瘤免疫微环境发生的变化。
6.肿瘤微环境细胞因子检测结果—TNF-α、TGF-β含量
通过测量小鼠外周血中TNF-α含量显示：正常对照组＞单纯荷瘤组＞单纯抑郁组＞抑郁荷瘤组，且P＜0.05,有统计学差异；在5组给药治疗组中，中药化疗组＞单纯化疗组＞单纯单体组＞单纯中药组＞单体化疗组＞抑郁荷瘤组，P＜0.05,有统计学差异。说明抑郁荷瘤模型可以通过促进血管新生促进肿瘤的生长，也可以通过抑制T细胞，降低机体的免疫力。药物干预后，中药加化疗药抑制肿瘤生长提高免疫力。
通过测量小鼠外周血中TGF-β含量显示：抑郁荷瘤组＞单纯荷瘤组＞单纯抑郁组＞正常对照组，且P＜0.05,有统计学差异；在5组给药治疗组中，单纯单体组＞单纯中药组＞单纯化疗组>单体化疗组＞中药化疗组＞抑郁荷瘤组，P＜0.05,有统计学差异。TGF-β是介导肿瘤免疫逃逸最有效的免疫抑制分子，可抑制各种免疫细胞在瘤组织中的浸润和增殖。
结论
1.借助肿瘤分子影像学技术对比观察中药复方疏肝健脾方和中药单体三七总皂苷干预作用显示：疏肝健脾方和三七总皂苷在抑制抑郁型乳腺癌的体积大小上虽不明显，但具有抑制肿瘤内部新生血管和淋巴管的浸润的作用。
2.疏肝健脾方联合化疗药物吉西他滨抑制抑郁型乳腺肿瘤效果最为显著，其机制与下调MDSC的表达，上调CD3+CD4+CD8+的表达，增强小鼠机体的免疫力有关。
3.疏肝健脾方联合吉西他滨可以发挥重塑T淋巴细胞亚群功能作用，与促进TNF-α表达，抑制TGF-β分泌有关。