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研究背景胰岛移植重建胰岛素分泌系统,是一种有望彻底根治糖尿病的治疗方法。2000年,Edmonton方案的成功,标志着胰岛移植取得了突破性的进展,从而带动了胰岛移植临床试验性治疗在世界范围内广泛展开。但是免疫排斥以及免疫抑制剂所带来的副作用和潜在危险性仍是难以克服的障碍。目前普遍认为,解决异体移植排斥反应的关键在于诱导受体对供体的细胞、组织或器官产生免疫耐受。由于移植免疫耐受的机制十分复杂,尽管诱导免疫耐受的方法众多,但均未能达到完全可靠持久的特异性耐受。细胞凋亡是生物体内普遍存在的一种生理和病理现象,是正常器官和组织发育、清除有害的、过量的和无功能细胞、维持自身稳态的必要环节。现有研究表明:凋亡是机体免疫状态保持平衡和稳定的重要作用机制,凋亡细胞对免疫系统存在着主动的调节作用。凋亡细胞能分泌脂类趋化因子,改变自身胞膜结构表达“eat-me”信号,诱导吞噬细胞对其进行清除;同时凋亡细胞被抗原提呈细胞吞噬后,通过吞噬细胞分泌抑制性免疫因子如TGF-β、PGE2、IL-10等,造成了特殊的抗原识别微环境,可以促使相关淋巴细胞针对凋亡抗原产生免疫耐受,而不会引起炎性免疫应答。据此,孙尔维等提出利用供体凋亡细胞输注来诱导供体特异性免疫耐受的理论设想。我们课题组以前的工作证实,凋亡细胞在体外对T淋巴细胞活化增殖有直接抑制作用;凋亡细胞预输注可以显著延长大鼠心脏移植模型、肝移植模型存活时间。因此,我们拟应用供体凋亡脾淋巴细胞静脉输注的方法,来诱导糖尿病大鼠同种异体胰岛移植的免疫耐受,以探求延长胰岛移植物存活的方法。目的初步探讨凋亡细胞静脉输注诱导胰岛移植免疫耐受,延长胰岛移植物存活时间的方法,为寻找诱导胰岛移植免疫耐受的方法开辟新的途径,提供新的依据。方法1、直线加速器照射对体外培养大鼠脾细胞凋亡的影响:采用研磨法获得Wistar大鼠脾淋巴细胞悬液。将脾细胞悬液加入细胞培养瓶,分四组,A组为对照组,B、C、D组应用Varian医用直线加速器照射,各组吸收剂量分别为:1.5Gy、2.0Gy、3.0Gy。各组细胞处理后置于37℃,5%CO2恒温培养箱培养。分别在培养后4h、8h、12h应用流式细胞仪检测细胞凋亡率;2、大鼠胰岛细胞的分离纯化:采用胶原酶P胰管灌注消化,短期低温培养后Ficoll-400不连续梯度纯化Wistar大鼠胰岛;3、建立糖尿病动物模型:以STZ（链脲佐菌素）（56mg/kg·体重）经腹腔一次性注射,制备SD大鼠实验性糖尿病模型（连续2次血糖＞16.7mmol/L）;4、供体凋亡细胞输注对糖尿病大鼠胰岛移植物的影响:以雄性Wistar大鼠为供体,雄性SD大鼠为受体。将糖尿病SD大鼠随机分为Hank’s液注射（A组）、正常供体脾细胞预输注（B组）、供体凋亡脾细胞预输注（C组）及供体坏死脾细胞预输注（D组）四组。各组在预处理7天后行胰岛移植,将1000IEQ的胰岛细胞移植入各组糖尿病大鼠的肾包囊内,比较各组移植物生存时间上的差异。同时各实验组分别在预处理后第7天（即胰岛移植术前）、胰岛移植术后7天、14天、排斥后应用放射免疫法测定大鼠血清胰岛素水平。供体凋亡脾细胞预输注糖尿病SD大鼠则在不同的移植时期（包含血糖正常期、排斥期两个时期）手术将移植物载体肾取出;其余各实验组在糖尿病SD大鼠移植物排斥后2天,取出其移植物载体肾,做胰岛素的免疫组化检测。5、供体凋亡细胞输注对胰岛移植糖尿病大鼠淋巴细胞增殖反应的影响:将糖尿病SD大鼠按上述方法分组,各组分别于预处理后第7天（即胰岛移植术前）、胰岛移植术后7天、14天、排斥后取大鼠脾脏,分离淋巴细胞,经刀豆蛋白A（ConcanavalinA ConA）刺激培养,利用CFSE（2羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）细胞染色法观察受体淋巴细胞增殖反应程度。结果1、直线加速器高能X线照射Wistar大鼠脾细胞,吸收剂量2.0Gy组各个时间点的凋亡率有差异（F=5.930,P=0.026）,且与对照组、1.5Gy组比较凋亡率有差异（P值均＜0.050）,以2.0Gy组、8小时的凋亡率较高。2、每条Wistar大鼠胰腺经分离、纯化后平均可获取的胰岛细胞团数量为（1063.91±84.74）IEQ,DTZ（双硫腙）染色显示纯度为（70.51±6.20）%。高糖刺激时胰岛β细胞胰岛素的释放量为低糖刺激时的2.72倍。3、以STZ（56mg/kg·体重）一次性经腹腔注射的方法,可成功诱发SD大鼠的试验性糖尿病,糖尿病模型建模成功率为94%。4、输注凋亡细胞组与输注Hank’s液组、输注正常细胞组、输注坏死细胞组之间的移植物存活时间有差异（P值均＜0.050）。平均存活天数为32天,最长达42天,以输注凋亡细胞组胰岛移植物存活时间最长。正常脾细胞输注组较输注Hank’s液组及坏死细胞组也有所延长。预输注Hank’s液及坏死细胞组则无此效应。5、预输注凋亡细胞组移植前胰岛素水平与移植后7天、移植后14天有差异（P值均＜0.050）,以移植后7天、14天较高。移植后14天输注凋亡细胞组与输注正常细胞组的胰岛素水平有差异（T=3.439,P=0.009）,以凋亡细胞组胰岛素水平最高,而预输注Hank’s液及坏死细胞组各时间点的胰岛素水平无差异（P值均＞0.050）。6、供体凋亡细胞预输注组胰岛移植物在受体血糖正常时取出做组织切片,经Insulin免疫组织化学染色证实有表达胰岛素阳性的胰岛细胞团存在,呈棕褐色。而在被排斥后取出的移植物进行免疫组化检测,则未发现胰岛素阳性的胰岛细胞团存在。输注Hank’s液组、输注供体正常细胞或坏死细胞组的移植物在被排斥后取出行Insulin免疫组化染色检测,亦无胰岛素阳性细胞存在。7、预输注凋亡细胞组移植前的淋巴细胞增殖指数与移植后14天、排斥后有差异（P值均＜0.050）,以移植前的增殖指数最低,移植前、移植后7天各组淋巴细胞增殖指数有差异（F=29.943,P=0.000）,以输注凋亡细胞组的增殖指数最低,这种抑制效应至移植后14天仍存在,排斥后则消失。结论1、直线加速器高能X线照射能在体外简便安全有效诱导大鼠脾细胞凋亡。2、采用胶原酶P胰管灌注消化,短期低温培养后Ficoll-400不连续梯度纯化能分离、纯化出较大数量且功能良好的大鼠胰岛细胞。3、预输注供体凋亡细胞能显著延长同种异体大鼠胰岛移植物的存活时间。应用供体凋亡细胞诱导胰岛移植免疫耐受是一条可行的途径。4、以体外淋巴细胞增殖实验证实,预输注供体凋亡细胞对受体鼠淋巴细胞经丝裂原ConA刺激的增殖反应具有抑制作用。