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目的:调查安徽省临床分离的产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的大肠埃希菌耐药状况,分析其流行病学特点,在此基础上对其做出总结分析,为合理使用抗菌药物提供依据,有利于预防产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌的流行。通过分子生物学方法,研究自安徽省各级医院收集的菌株有无新耐药基因及引起酶蛋白分子结构发生变化的基因位点的改变,以期发现酶的新的活性部位,并将发现的新基因进行克隆表达,研究其生物学特性,明确其功能,为新型药物设计提供靶位依据,从而降低病死率,减少医疗费用。材料与方法:菌株来源:2006年随机月份收集的安徽省细菌耐药中心41家成员医院临床分离无重复产ESBLs大肠埃希菌共416株。方法:使用blaCTX-M四对通用引物以PCR方法进行扩增以筛选出CTX-M+菌株。根据通用引物扩增结果,设计两对全编码区扩增引物,为方便后续试验,5`端分别加EcoRΙ和BamHΙ酶切位点。将PCR阳性的菌株行转移接合试验,EcoRΙ和BamHΙ酶切获得其全编码基因进行单链构象多态性分析(single-strand conformation polymorphism;SSCP)筛选出可能的碱基突变株。对多次测序并经GenBank比对后确定的产新酶菌株进行以下实验:PCR扩增野生株和/或转移接合子中的CTX-M型β-内酰胺酶编码基因片段,克隆入pUC-118载体,表达于感受态细胞大肠埃希菌JM109中。在EcoRΙ和BamHΙ酶切之后,将新基因型全编码基因克隆入表达载体pHSG398,将新酶全编码基因克隆入表达载体pHSG398,转化于感受态细胞大肠埃希菌JM109中,用加有抗菌药物的琼脂平板进行转化株筛选。用琼脂倍比稀释法对野生株、接合子与转化株同时进行MIC测定。采用超声破碎法进行产新酶细菌转化株的粗酶提取,等电聚焦电泳测定其等电点(pI)。对粗酶纯化后,SDS-PAGE和考马斯蓝染色测定新酶分子量大小,进行酶促反应动力学研究,以初步了解新酶的动力学特性。结果:217株大肠埃希菌经通用引物PCR法被证实产CTX-M酶;占产ESBLs菌株的52.2%(217/416);共201株大肠埃希菌转移接合成功;野生株的MIC结果显示对氨苄西林、头孢呋辛、头孢噻肟和头孢曲松钠的耐药率最高,达到100%,对亚胺培南和美罗培南全部敏感;接合子与转化株的耐药性较野生株有所下降,对氟喹诺酮的敏感性明显增加。CTX-M-1组引物的扩增结果共有53株细菌呈阳性;CTX-M-9组引物的扩增结果共有164株细菌呈阳性;其中19株呈二者共同阳性;CTX-M-2组及CTX-M-8组通用引物的扩增结果无阳性发现。SSCP结果分析显示,CTX-M-1型13株阳性结果,CTX-M-9型29株阳性结果。对42株产酶菌PCR产物的测序结果进行BLAST分析,发现有1株细菌携带新CTX-M基因型,突变位点位于活性中心167位氨基酸,其基因序列已提交GenBank,获得的登录号为:EU545409,并经Jacoby G A认证并命名为CTX-M-87。携带CTX-M-87的大肠埃希菌E.coli p168的转移接合实验与克隆表达实验全部成功。其野生株、接合子及转化株的MIC结果显示:转化株对抗菌药物的耐药性有所下降,但依然表现为优先水解头孢噻肟钠和头孢曲松钠。等电聚焦结果表明,CTX-M-87等电点为9.1,蛋白质分子量为28kDa,酶促反应动力学研究,初步了解新酶对7种常用抗菌药物的Km值和Vmax值,结果显示:该酶对头孢他啶、氨曲南的水解效率较低。结论:安徽省细菌耐药中心41家成员医院中中有产CTX-M酶的大肠埃希菌检出;无论野生株或接合子均表现对头孢呋辛、头孢噻肟钠和头孢曲松钠高度耐药,但是接合子的耐药性较野生株有所下降。本地区CTX-M酶以CTX-M-1组和CTX-M-9组为主,其中CTX-M-9组的检出率高于CTX-M-1组,同时出现CTX-M-9组变异型,其耐药表型表现与母系酶没有显著差别。