研究背景:近年来3D生物打印技术发展迅速,已成为创建体外组织和器官等生物模型的重要方法之一。3D生物打印皮肤、软骨、胰腺、肾脏、肺和心脏等复杂的组织和器官被陆续报道,这些组织和器官不仅具有人体对应组织和器官的形态特征,部分还具有良好的生物学功能。肝脏是人体最大的消化腺,具备生物合成、药物代谢和凝血等众多关键的生理功能,而药物性肝损伤、病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等众多累及肝脏的相关疾病已成为威胁人类健康的主要因素,但目前尚缺少可靠的肝脏相关体外研究模型。我们的研究旨在利用3D生物打印技术构建肝脏和肝癌相关体外模型,并初步验证其功能和应用价值。研究方法:在构建3D生物打印肝脏模型研究中,我们以HepaRG为细胞种子,明胶/海藻酸钠为生物墨水,利用挤出式3D生物打印机构建网格状体外人肝组织（3D bioprinted hepatorganoids,3DP-HOs）。我们首选从生物墨水配比、打印环境温度和细胞诱导方法等三个方面确定3D生物打印和后续细胞培养最佳实验参数,之后从3DP-HOs形态特征、细胞存活染色和CCK8增殖试验等方面验证模型的创建是否成功。3D生物打印肝组织创建成功后,通过qPCR和ELISA检测并比较原代肝细胞、未诱导分化HepaRG、2D诱导培养HepaRG、3D诱导培养HepaRG和3DP-HOs各组肝脏特异基因和蛋白的表达;利用免疫荧光染色验证3DP-HOs特异蛋白的表达;采用PAS染色、ICG摄取和排泄试验及LDL摄取试验评估3DP-HOs特定功能;通过qPCR和P450-Glo TM Assays检测3-甲基胆蔥、苯巴比妥钠和利福平诱导前后各组多种CYP450酶的基因表达和活性。最终我们将3DP-HOs移植到肝损伤Fah-/-Rag2-/-小鼠腹腔,通过观察移植的3DP-HOs在体内的融合情况、异哇胍代谢作用和对肝损伤小鼠肝脏相关生理指标和生存期的影响来评估3D生物打印肝组织的体内功能。在利用3D生物打印制造肝癌相关模型探索中,HepG2和明胶-海藻酸钠分别为肝癌细胞和生物墨水,利用同3DP-HOs相似的挤出式3D生物打印工艺创建网格状肝癌模型（3D bioprinted HepG2,3DP-HepG2）。该模型创建的效果从形态特征和细胞存活状态等角度评估。利用Ki67评估3DP-HepG2中细胞增殖情况,采用qPCR技术检测3DP-HepG2和2D培养细胞在肝脏、肝癌、自噬和耐药等方面相关基因的表达,通过免疫荧光评估特征蛋白的表达,借助转录组测序技术和生物信息学分析表征3DP-HepG2和2D培养细胞表达谱和筛选核心差异基因。最后通过顺铂、索拉菲尼和瑞格菲尼药物试验,评估DP-HepG2和2D培养药物反应差异。研究结果:我们最终选择了 4%明胶/1%海藻酸钠作为生物墨水,在10℃（打印室温度）/20℃（材料室温度）环境下成功构建了10×10×3mm3的网格状肝组织。3DP-HOs长期培养可保持90%以上的细胞活力,且稳定增殖。诱导培养7天后,3DP-HOs含82.5%±4.6%白蛋白阳性肝细胞,且在基因表达层面比HepaRG、2D和3D培养组表达更高的 ALB、AAT、CK18、MRP2、Transferrin、FOXA2 和 HNF4A。功能蛋白的定量分析和免疫荧光结果与此一致。CYP诱导试验显示,CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4 和 CYP3A11 基因表达均可以在 3DP-HOs 中被诱导增强,其中CYP1A2和CYP3A4在药物诱导后活性得到明显增强（2倍以上）。此外,3DP-HOs获得了糖原贮存能力、ICG摄取和排泄能力以及LDL摄取能力。3DP-HOs被移植到小鼠体内后,3DP-HOs改善了Fah-/-Rag2-/-小鼠肝损伤状况,降低了多种氨基酸水平,并最终延长了小鼠生存期。在移植2周后检测发现移植物3DP-HOs具备了血管网络,并可以分泌ALB、AAT、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅲ和凝血因子Ⅸ等人功能蛋白,且发现3DP-HOs可在体内代谢异哇胍。3DP-HepG2具有DP-HOs同样大小尺寸,模型内的细胞打印后第1到10天始终保持90%左右高细胞活率,Ki67表达呈强阳性。与2D-HepG2相比,3DP-HepG2始终表达更高的ALB、AAT和CYP3A4等肝脏相关基因以及AFP、CD133、EpCAM、IL8和CD24等肿瘤相关基因。转录组分析发现3DP-HepG2具有独特的基因表达谱,尤其在肝功能和肿瘤特异基因上和2D-HepG2差异明显,同时筛选出ALB和NOTUM等核心差异基因。药物试验显示,顺铂、索拉菲尼和瑞格菲尼在3DP-HepG2/2D-HepG2中的IC50分别是 38.56μM/12.03μM,22.07μM/6.53μM和 7.93μM/1.96μM。qPCR 结果显示3DP-HepG2始终表达更高的MRP1、ACBC、MDR1和EGFR等耐药相关基因和Beclin3-1、LC3A、LC3B和Atg5等自噬相关基因。研究结论:基于3D生物打印构建的肝组织具有蛋白合成和药物代谢等良好的肝功能,移植后能改善肝衰小鼠肝损伤、延期生存期,显示出潜在的移植治疗作用;3D生物打印的肝癌组织与2D细胞相比在肝功能和肿瘤特性方面具有独特的生物学特征,在药物筛选方面具有潜在应用价值。