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目的:建立大鼠膜性肾病(MN)模型,验证柴苓益肾汤对大鼠MN抗磷脂酶A2受体抗体(Anti-PLA2R )及蛋白尿的影响,初步探讨其治疗MN的作用机制是否与Anti-PLA2R的表达有关。
实验方法:首先应用阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)建立大鼠MN模型;将健康清洁的3月龄雄性SD大鼠,体重(200±20)g/只,共30只,适应性喂养1周后,随机分为3组:正常对照组、模型组、柴苓益肾汤组(给药组),每组各10只。对模型组、给药组大鼠进行预免疫实验1周后,应用C-BSA正式免疫造模3周,建立大鼠MN模型。造模结束后,即实验的第4周末用代谢笼法收集3组大鼠24h尿液,采用考纳斯亮蓝法(CBB法)进行尿蛋白定量测定。之后对正常对照组、模型组给予等计量生理盐水(2ml/200g/d)灌喂,给药组给予柴苓益肾汤浓缩液治疗,按大鼠不同体重进行灌喂,比例为0.6ml/100g。给药4周后,即实验的第8周末用代谢笼法收集3组大鼠24h尿液,采用考纳斯亮蓝法(CBB法)进行尿蛋白定量测定。收集尿液结束后处死大鼠,开腹找到腹主动脉,用采血器抽取8ml左右全血,制备血清样本,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测Anti-PLA2R。检测大鼠Anti-PLA2R、24h尿蛋白定量等指标后,做统计学分析,取大鼠肾脏样本,外送做切片行马松Masson染色。
结果:24h尿蛋白定量:实验4周后,正常对照组24h尿蛋白平均值7.38±0.62mg,模型组24h尿蛋白平均值91.09±3.02mg,给药组24h尿蛋白平均值93.30±3.64mg。8周后,正常对照组24h尿蛋白平均值8.39±0.46mg,模型组24h尿蛋白平均值103.63±9.03mg,给药组24h尿蛋白平均值42.10±2.73mg。实验4周后,与正常对照组相比,模型组与给药组尿蛋白总量有显著差异(P<0.001),而模型组与给药组相比无显著差异。实验8周后(即柴苓益肾汤在给药4周后),与模型组相比,给药组的尿蛋白总量明显降低P<0.001。
抗磷脂酶A2受体抗体:实验8周后,正常对照组Anti-PLA2R值为0.20±0.038,模型组Anti-PLA2R值为0.48±0.055,给药组Anti-PLA2R值为0.38±0.037。实验8周后(即柴苓益肾汤在给药4周后)给药组的Anti-PLA2R明显降低,与模型组相比较P<0.01。
Masson染色:肉眼观察,与正常对照组、给药组相比较,模型组稍显苍白;正常对照组光镜下无异常;模型组光镜下显示,膜性肾病早期,上皮下少量嗜复红蛋白沉积。给药组光镜下与模型组对比,显示上皮下嗜复红蛋白沉积减少。
结论:结合大鼠24h尿蛋白、Anti-PLA2R、Masson染色光镜下病理改变说明造模成功。灌喂柴苓益肾汤4周后与模型组相比,给药组的尿蛋白、Anti-PLA2R显著降低,表明长期服用柴苓益肾汤可以降低大鼠MN的尿蛋白,降低大鼠MN体内的Anti-PLA2R,同时病理切片表明,其改善了大鼠MN肾组织的病理变化。初步推断长期服用柴苓益肾汤对大鼠MN有较好的治疗作用并且无明显的毒副作用,Anti-PLA2R的表达可能是尿蛋白减少的机制之一,在临床中可以使用柴苓益肾汤治疗膜性肾病。
实验方法:首先应用阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)建立大鼠MN模型;将健康清洁的3月龄雄性SD大鼠,体重(200±20)g/只,共30只,适应性喂养1周后,随机分为3组:正常对照组、模型组、柴苓益肾汤组(给药组),每组各10只。对模型组、给药组大鼠进行预免疫实验1周后,应用C-BSA正式免疫造模3周,建立大鼠MN模型。造模结束后,即实验的第4周末用代谢笼法收集3组大鼠24h尿液,采用考纳斯亮蓝法(CBB法)进行尿蛋白定量测定。之后对正常对照组、模型组给予等计量生理盐水(2ml/200g/d)灌喂,给药组给予柴苓益肾汤浓缩液治疗,按大鼠不同体重进行灌喂,比例为0.6ml/100g。给药4周后,即实验的第8周末用代谢笼法收集3组大鼠24h尿液,采用考纳斯亮蓝法(CBB法)进行尿蛋白定量测定。收集尿液结束后处死大鼠,开腹找到腹主动脉,用采血器抽取8ml左右全血,制备血清样本,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测Anti-PLA2R。检测大鼠Anti-PLA2R、24h尿蛋白定量等指标后,做统计学分析,取大鼠肾脏样本,外送做切片行马松Masson染色。
结果:24h尿蛋白定量:实验4周后,正常对照组24h尿蛋白平均值7.38±0.62mg,模型组24h尿蛋白平均值91.09±3.02mg,给药组24h尿蛋白平均值93.30±3.64mg。8周后,正常对照组24h尿蛋白平均值8.39±0.46mg,模型组24h尿蛋白平均值103.63±9.03mg,给药组24h尿蛋白平均值42.10±2.73mg。实验4周后,与正常对照组相比,模型组与给药组尿蛋白总量有显著差异(P<0.001),而模型组与给药组相比无显著差异。实验8周后(即柴苓益肾汤在给药4周后),与模型组相比,给药组的尿蛋白总量明显降低P<0.001。
抗磷脂酶A2受体抗体:实验8周后,正常对照组Anti-PLA2R值为0.20±0.038,模型组Anti-PLA2R值为0.48±0.055,给药组Anti-PLA2R值为0.38±0.037。实验8周后(即柴苓益肾汤在给药4周后)给药组的Anti-PLA2R明显降低,与模型组相比较P<0.01。
Masson染色:肉眼观察,与正常对照组、给药组相比较,模型组稍显苍白;正常对照组光镜下无异常;模型组光镜下显示,膜性肾病早期,上皮下少量嗜复红蛋白沉积。给药组光镜下与模型组对比,显示上皮下嗜复红蛋白沉积减少。
结论:结合大鼠24h尿蛋白、Anti-PLA2R、Masson染色光镜下病理改变说明造模成功。灌喂柴苓益肾汤4周后与模型组相比,给药组的尿蛋白、Anti-PLA2R显著降低,表明长期服用柴苓益肾汤可以降低大鼠MN的尿蛋白,降低大鼠MN体内的Anti-PLA2R,同时病理切片表明,其改善了大鼠MN肾组织的病理变化。初步推断长期服用柴苓益肾汤对大鼠MN有较好的治疗作用并且无明显的毒副作用,Anti-PLA2R的表达可能是尿蛋白减少的机制之一,在临床中可以使用柴苓益肾汤治疗膜性肾病。