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7,8-二羟基黄酮（7,8-dihydroxyflavone，7,8-DHF）是自然界存在的一种较为罕见的黄酮类化合物，迄今报道仅在美国中南部植物Godmania aesculifolia、长柄菊（Tridax procumbens）、报春花（Primula）及湖北海棠（Malus hupehensis）中被检出。大量的研究表明，7,8-DHF作为原肌球蛋白受体激酶B（TrkB）的小分子激动剂，可进一步激活TrkB下游的MAPK/ERK、PI3K/Akt以及PC3K三条信号通路，能模拟脑源性神经营养因子（BDNF）的功能。目前，7,8-DHF已被应用于各类BDNF/TrkB信号相关疾病（如阿尔兹海默症、帕金森综合症、亨廷顿舞蹈症、Rett综合症、抑郁症等）及代谢综合征（如肥胖）的防治研究，并取得丰硕成果。然而，天然来源的植物黄酮普遍存在口服生物利用度低的问题。7,8-DHF的A环邻二羟基在肝脏中极易被甲基化、糖基化以及硫酸化，因而动物试验（C57BL/6小鼠）测得其口服生物利用度仅为4.6%。对其进行化学结构修饰后的前药（R13）绝对口服生物利用度提高到10.5%，但此举并不适用于食品功能因子的开发。
本文在探索7,8-DHF消化吸收机制的基础上，着眼于纳米化的物理改造手段，精选不同的食源性生物大分子进行优化组合构建纳米递质，以显著提升7,8-DHF的口服生物利用度。首先，采用体外Caco-2单层细胞模型，研究7,8-DHF的跨膜转运机制，并筛选出一些能提高7,8-DHF跨膜转运效率的植物黄酮。接着，以玉米醇溶蛋白（zein）为主成分，辅以乳铁蛋白（LF）、表面活性剂（槐糖脂）及多糖（海藻酸钠、羧甲基纤维素钠）等，采用反溶剂共沉淀法构建二元和三元纳米递质，对其理化特性、结构特征及体系稳定性进行测评，在此基础上高效包封7,8-DHF。最后，对7,8-DHF复合生物纳米材料进行结构表征，并对其贮藏稳定性、体外抗消化能力和口服生物利用度进行系统研究。主要研究内容和结果如下：
1.利用Caco-2单层细胞模型探究7,8-DHF在不同条件（试样浓度、处理时间、体系pH值、代谢抑制剂存在与否等）下的双向通透性，并分析了其外排和涌入特性。结果表明，7,8-DHF透过Caco-2单层细胞膜的能力较弱，无论是从AP→BL侧，还是从BL→AP侧。7,8-DHF的转运能力与时间和浓度呈正相关，表明其主要转运机制是跨膜被动扩散。当模拟体系的pH值从7.4降至6.0时，7,8-DHF的转运效率显著增强。同时，其转运受到代谢抑制剂的强烈抑制。7,8-DHF的外排率（ER）大于1.5，说明Caco-2细胞模型中存在外排转运体，受到如ATP结合蛋白家族的P-糖蛋白（P-gp）及多药耐药相关蛋白（MRPs）介导的主动外排作用的影响。同时，有机阳离子转运蛋白（OCTs）和有机阴离子转运多肽（OATPs）则参与了7,8-DHF的主动涌入。研究表明，7,8-DHF的跨膜转运机制可能是通过能量依赖型的被动易化扩散途径。
2.采用Caco-2单层细胞模型，从天然来源的植物黄酮中筛选能够促进7,8-DHF转运的外排蛋白（P-gp）抑制剂，并研究其对7,8-DHF体外消化稳定性的影响。结果表明，槲皮素和山奈酚可以提高7,8-DHF在Caco-2单层细胞模型中的转运效率。7,8-DHF在模拟胃液和肠液中可保持结构的稳定性，与槲皮素和山奈酚共存时对其稳定性无影响。
3.采用反溶剂共沉淀（ASCP）法制备了稳定的玉米醇溶蛋白（zein）/乳铁蛋白（LF）二元纳米递质。研究结果表明，zein/LF递质的平均粒径为74nm，多分散指数（PDI）＜0.200，浊度值＜0.300，在较宽的pH范围内（3.0~9.0）表现出良好的稳定性，在中性条件（pH=7）下可耐受大范围的离子强度（0~500mmol/L NaCl），并可长期储存。Zein/LF二元递质对7,8-DHF的包封率（EE）可达98.31%，显著高于zein的一元递质（46.38%）。负载7,8-DHF后的zein/LF纳米冻干粉具有良好的复水性（复水后溶液的EE值为92.66%、PDI值为0.265）。荧光猝灭试验结果显示，LF和zein均可通过疏水作用与7,8-DHF结合，结合位点数分别为1.23和1.29。透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）观察显示，zein纳米粒子呈球形，LF的存在改变了它的表面形貌。X-射线衍射（XRD）结果表明，被纳米递质包封后的7,8-DHF从结晶态转变为非晶态。红外光谱（IR）分析结果表明，zein与LF之间依靠氢键和疏水力聚合，而zein与7,8-DHF之间存在静电、氢键和疏水力等非共价相互作用。
为了进一步提高zein二元递质的稳定性，采用三种不同分子量（10、40和70kDa）的葡聚糖，通过美拉德反应对LF进行接枝化，形成糖基化的LF后重新构建二元递质。结果表明，三种zein/糖基化LF纳米递质的平均粒径范围在67~87nm，PDI＜0.230，浊度＜0.220，在pH3.0~9.0的范围内可耐受不同的离子强度（0~500mmol/L NaCl）。同时，Zein/糖基化LF纳米递质进一步提高了负载7,8-DHF的能力（包封率＞98.50%）。差示扫描量热分析（DSC）表明，zein/糖基化LF纳米递质的热稳定性与相应的非糖基化体系相比得到了显著提升,IR分析证实zein和糖基化LF之间形成了更强的氢键和疏水作用。
4.通过ASCP法以不同方式添加生物表面活性剂----槐糖脂，制备了两种负载7,8-DHF的zein/-槐糖脂纳米粒子,即DHF-Z-S（将槐糖脂溶于乙醇相）和DHF-Z/S（槐糖脂溶于水相）。结果表明，zein与槐糖脂的质量比以及槐糖脂的添加方式对纳米粒子的理化性质有显著影响，相比较于DHF-Z/S，DHF-Z-S的结构具为致密，具有更小的粒径、更低的PDI和浊度值、更高的zeta电位电动势、包封率（EE）和荷载能力（LC）。TEM和SEM观察显示，DHF-Z-S和DHF-Z/S纳米粒子呈核-壳结构的球形，槐糖脂的存在改变了粒子的表面形貌。XRD分析表明，包封后的7,8-DHF呈非结晶态。IR和荧光光谱分析证实，zein和槐糖脂之间形成了有效的氢键、静电和疏水作用，且DHF-Z-S与DHF-Z/S相比，这种非共价作用力更强。同时，圆二色谱（CD）分析显示，7,8-DHF和槐糖脂均显著改变了zein的二级结构。
在此基础上，进一步制备zein-槐糖脂-多糖[海藻酸钠（ALG）和羧甲基纤维素钠（CMC）]的三元递质。结果表明，zein与多糖的质量比及多糖种类显著影响了纳米粒子的理化性质，包括粒径、PDI、zeta电位电动势和浊度。ALG和CMC的存在进一步增强了DHF-Z-S的EE值，并解决了原zein-槐糖脂体系在低pH条件下的沉淀问题。IR分析证实了zein、槐糖脂和多糖之间形成了有效的氢键、静电和疏水作用。CD分析显示，CMC和ALG对DHF-Z-S纳米粒子中zein的二级结构无明显影响。DSC结果表明，CMC和ALG的加入增强了体系的热稳定性。TEM和SEM分析显示,此三元粒子呈纳米级的球状（直径＞150nm），多糖的存在改变了DHF-Z-S复合纳米粒子的表面形貌。
5.对负载7,8-DHF后的zein二元和三元纳米粒子进行贮藏稳定性、体外抗消化性、体外生物可及度和口服生物利用度的研究。结果表明，纳米化技术显著增强了7,8-DHF在贮藏过程（环境温度分别为25℃和50℃）中的稳定性。体外模拟消化结果显示，zein/糖基化LF的二元递质和zein-槐糖脂-多糖的三元递质均对胃液和肠液有着良好的抗消化性，有利于保障目标物在人体消化道中的结构稳定。SEM观察可见，所构建的不同复合生物纳米材料在体外模拟消化完成后虽然平均粒径有所增加但仍基本保持球形，不同的纳米化处理技术显著提高了7,8-DHF的体外生物可及度（增加了1.76~4.65倍）。尤为重要的是，大鼠的药代动力学试验结果显示，zein/糖基化LF的二元递质和zein-槐糖脂-多糖的三元递质均显著增加7,8-DHF的口服生物利用度，与原药相比相对生物利用度提高了3.83~8.46倍，并且由于纳米材料的缓释性显著延长了7,8-DHF在大鼠血液中的保留时间。
综上所述，有理由认为7,8-DHF透过肠上皮细胞的跨膜转运机制主要是能量依赖的外排蛋白和涌入蛋白介导的被动易化扩散途径。本研究所构建的zein/糖基化LF二元递质和zein-槐糖脂-多糖三元递质均能高效包封7,8-DHF，形成的复合生物纳米材料具有良好的理化稳定性和抗消化性能，纳米化技术大幅度提高了7,8-DHF的体外生物可及度和大鼠的口服生物利用度（最高提升了8.46倍）。此外，本研究采用的原辅料均为来源于食物的组分，制作过程所涉的有机溶剂仅为食用酒精（乙醇），原料来源的天然性和生产过程的绿色化可保障7,8-DHF复合生物纳米材料的食用安全性。在食品功能因子的研发领域，尤其是针对以黄酮和酚酸为代表的小分子化合物，纳米化技术显示了十分广阔的应用价值和产业前景。
本文在探索7,8-DHF消化吸收机制的基础上，着眼于纳米化的物理改造手段，精选不同的食源性生物大分子进行优化组合构建纳米递质，以显著提升7,8-DHF的口服生物利用度。首先，采用体外Caco-2单层细胞模型，研究7,8-DHF的跨膜转运机制，并筛选出一些能提高7,8-DHF跨膜转运效率的植物黄酮。接着，以玉米醇溶蛋白（zein）为主成分，辅以乳铁蛋白（LF）、表面活性剂（槐糖脂）及多糖（海藻酸钠、羧甲基纤维素钠）等，采用反溶剂共沉淀法构建二元和三元纳米递质，对其理化特性、结构特征及体系稳定性进行测评，在此基础上高效包封7,8-DHF。最后，对7,8-DHF复合生物纳米材料进行结构表征，并对其贮藏稳定性、体外抗消化能力和口服生物利用度进行系统研究。主要研究内容和结果如下：
1.利用Caco-2单层细胞模型探究7,8-DHF在不同条件（试样浓度、处理时间、体系pH值、代谢抑制剂存在与否等）下的双向通透性，并分析了其外排和涌入特性。结果表明，7,8-DHF透过Caco-2单层细胞膜的能力较弱，无论是从AP→BL侧，还是从BL→AP侧。7,8-DHF的转运能力与时间和浓度呈正相关，表明其主要转运机制是跨膜被动扩散。当模拟体系的pH值从7.4降至6.0时，7,8-DHF的转运效率显著增强。同时，其转运受到代谢抑制剂的强烈抑制。7,8-DHF的外排率（ER）大于1.5，说明Caco-2细胞模型中存在外排转运体，受到如ATP结合蛋白家族的P-糖蛋白（P-gp）及多药耐药相关蛋白（MRPs）介导的主动外排作用的影响。同时，有机阳离子转运蛋白（OCTs）和有机阴离子转运多肽（OATPs）则参与了7,8-DHF的主动涌入。研究表明，7,8-DHF的跨膜转运机制可能是通过能量依赖型的被动易化扩散途径。
2.采用Caco-2单层细胞模型，从天然来源的植物黄酮中筛选能够促进7,8-DHF转运的外排蛋白（P-gp）抑制剂，并研究其对7,8-DHF体外消化稳定性的影响。结果表明，槲皮素和山奈酚可以提高7,8-DHF在Caco-2单层细胞模型中的转运效率。7,8-DHF在模拟胃液和肠液中可保持结构的稳定性，与槲皮素和山奈酚共存时对其稳定性无影响。
3.采用反溶剂共沉淀（ASCP）法制备了稳定的玉米醇溶蛋白（zein）/乳铁蛋白（LF）二元纳米递质。研究结果表明，zein/LF递质的平均粒径为74nm，多分散指数（PDI）＜0.200，浊度值＜0.300，在较宽的pH范围内（3.0~9.0）表现出良好的稳定性，在中性条件（pH=7）下可耐受大范围的离子强度（0~500mmol/L NaCl），并可长期储存。Zein/LF二元递质对7,8-DHF的包封率（EE）可达98.31%，显著高于zein的一元递质（46.38%）。负载7,8-DHF后的zein/LF纳米冻干粉具有良好的复水性（复水后溶液的EE值为92.66%、PDI值为0.265）。荧光猝灭试验结果显示，LF和zein均可通过疏水作用与7,8-DHF结合，结合位点数分别为1.23和1.29。透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）观察显示，zein纳米粒子呈球形，LF的存在改变了它的表面形貌。X-射线衍射（XRD）结果表明，被纳米递质包封后的7,8-DHF从结晶态转变为非晶态。红外光谱（IR）分析结果表明，zein与LF之间依靠氢键和疏水力聚合，而zein与7,8-DHF之间存在静电、氢键和疏水力等非共价相互作用。
为了进一步提高zein二元递质的稳定性，采用三种不同分子量（10、40和70kDa）的葡聚糖，通过美拉德反应对LF进行接枝化，形成糖基化的LF后重新构建二元递质。结果表明，三种zein/糖基化LF纳米递质的平均粒径范围在67~87nm，PDI＜0.230，浊度＜0.220，在pH3.0~9.0的范围内可耐受不同的离子强度（0~500mmol/L NaCl）。同时，Zein/糖基化LF纳米递质进一步提高了负载7,8-DHF的能力（包封率＞98.50%）。差示扫描量热分析（DSC）表明，zein/糖基化LF纳米递质的热稳定性与相应的非糖基化体系相比得到了显著提升,IR分析证实zein和糖基化LF之间形成了更强的氢键和疏水作用。
4.通过ASCP法以不同方式添加生物表面活性剂----槐糖脂，制备了两种负载7,8-DHF的zein/-槐糖脂纳米粒子,即DHF-Z-S（将槐糖脂溶于乙醇相）和DHF-Z/S（槐糖脂溶于水相）。结果表明，zein与槐糖脂的质量比以及槐糖脂的添加方式对纳米粒子的理化性质有显著影响，相比较于DHF-Z/S，DHF-Z-S的结构具为致密，具有更小的粒径、更低的PDI和浊度值、更高的zeta电位电动势、包封率（EE）和荷载能力（LC）。TEM和SEM观察显示，DHF-Z-S和DHF-Z/S纳米粒子呈核-壳结构的球形，槐糖脂的存在改变了粒子的表面形貌。XRD分析表明，包封后的7,8-DHF呈非结晶态。IR和荧光光谱分析证实，zein和槐糖脂之间形成了有效的氢键、静电和疏水作用，且DHF-Z-S与DHF-Z/S相比，这种非共价作用力更强。同时，圆二色谱（CD）分析显示，7,8-DHF和槐糖脂均显著改变了zein的二级结构。
在此基础上，进一步制备zein-槐糖脂-多糖[海藻酸钠（ALG）和羧甲基纤维素钠（CMC）]的三元递质。结果表明，zein与多糖的质量比及多糖种类显著影响了纳米粒子的理化性质，包括粒径、PDI、zeta电位电动势和浊度。ALG和CMC的存在进一步增强了DHF-Z-S的EE值，并解决了原zein-槐糖脂体系在低pH条件下的沉淀问题。IR分析证实了zein、槐糖脂和多糖之间形成了有效的氢键、静电和疏水作用。CD分析显示，CMC和ALG对DHF-Z-S纳米粒子中zein的二级结构无明显影响。DSC结果表明，CMC和ALG的加入增强了体系的热稳定性。TEM和SEM分析显示,此三元粒子呈纳米级的球状（直径＞150nm），多糖的存在改变了DHF-Z-S复合纳米粒子的表面形貌。
5.对负载7,8-DHF后的zein二元和三元纳米粒子进行贮藏稳定性、体外抗消化性、体外生物可及度和口服生物利用度的研究。结果表明，纳米化技术显著增强了7,8-DHF在贮藏过程（环境温度分别为25℃和50℃）中的稳定性。体外模拟消化结果显示，zein/糖基化LF的二元递质和zein-槐糖脂-多糖的三元递质均对胃液和肠液有着良好的抗消化性，有利于保障目标物在人体消化道中的结构稳定。SEM观察可见，所构建的不同复合生物纳米材料在体外模拟消化完成后虽然平均粒径有所增加但仍基本保持球形，不同的纳米化处理技术显著提高了7,8-DHF的体外生物可及度（增加了1.76~4.65倍）。尤为重要的是，大鼠的药代动力学试验结果显示，zein/糖基化LF的二元递质和zein-槐糖脂-多糖的三元递质均显著增加7,8-DHF的口服生物利用度，与原药相比相对生物利用度提高了3.83~8.46倍，并且由于纳米材料的缓释性显著延长了7,8-DHF在大鼠血液中的保留时间。
综上所述，有理由认为7,8-DHF透过肠上皮细胞的跨膜转运机制主要是能量依赖的外排蛋白和涌入蛋白介导的被动易化扩散途径。本研究所构建的zein/糖基化LF二元递质和zein-槐糖脂-多糖三元递质均能高效包封7,8-DHF，形成的复合生物纳米材料具有良好的理化稳定性和抗消化性能，纳米化技术大幅度提高了7,8-DHF的体外生物可及度和大鼠的口服生物利用度（最高提升了8.46倍）。此外，本研究采用的原辅料均为来源于食物的组分，制作过程所涉的有机溶剂仅为食用酒精（乙醇），原料来源的天然性和生产过程的绿色化可保障7,8-DHF复合生物纳米材料的食用安全性。在食品功能因子的研发领域，尤其是针对以黄酮和酚酸为代表的小分子化合物，纳米化技术显示了十分广阔的应用价值和产业前景。