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目的:本研究通过将中药黄芪甲苷负载有4-乙烯基苯硼酸(PBA)-聚乙二醇二丙烯酸酯700(PEGDA)的超支化聚合物,与巯基化的透明质酸(HA-SH)进行反应,并加入纳米金颗粒,得到芪甲苷负载的HB(PEG-PBA)/HA-SH/GNRs可注射的导电水凝胶。首先检测该复合导电水凝胶的表征及体内、体外释放药物的情况;进而采用结扎冠状动脉左前降支手术制备大鼠心肌梗死模型,将该水凝胶体系原位注射到大鼠心肌组织,28天后利用高分辨率小动物超声影像学、血流动力学、病理切片染色、免疫荧光、RT-PCR、Western Blot等相关实验技术,考察黄芪甲苷负载HB(PEG-PBA)/HA-SH/GNRs导电水凝胶对模型大鼠心脏功能、心肌细胞导电的特异性效应以及凋亡信号通路的影响,探讨黄芪甲苷负载HB(PEG-PBA)/HA-SH/GNRs导电水凝胶对心肌梗死防治的药效作用及机制。方法:1利用迈克尔加成反应合成超支化聚合物聚乙二醇二丙烯酸酯-4-乙烯基苯硼酸(PEGDA-PBA),在超支化聚合物聚乙二醇二丙烯酸酯-4-乙烯基苯硼酸(PEGDA-PBA)中成功对接的PBA通过羟基间的氢键作用吸附难溶于水的黄芪甲苷纳米微球,从而增加该水凝胶体系的载药量;进一步向该复合水凝胶体系中加入纳米金颗粒,从而增加其导电性;巯基化透明质酸(HA-SH)与聚合物上残余的双键反应从而使该水凝胶快速成胶,达到可注射目的。通过核磁共振、红外光谱对超支化聚合物PBA-PEGDA进行结构表征;通过力学性能测试检测凝胶材料的强度;采用TEM透射电镜观测纳米级颗粒的形态;测定不同组别水凝胶的导电性及药物释放性能;并对该导电水凝胶进行细胞毒性测试。2采用结扎冠状动脉左前降支手术制备大鼠心肌梗死模型,随机分为假手术组(Sham)、模型组(MI)、负载高剂量黄芪甲苷的水凝胶组(HB(PEG-PBA)/HA-SH/AST NPs(40mg/kg))、负载低剂量黄芪甲苷的纳米金水凝胶组(HB(PEG-PBA)/HA-SH/AST NPs(20mg/kg)GNRs)、负载高剂量黄芪甲苷的纳米金水凝胶组(HB(PEG-PBA)/HA-SH/AST NPs(40mg/kg)GNRs)以及单纯水凝胶组(HB(PEG-PBA)/HA-SH)。分别选取手术后的第7、14、28天时间点对各组大鼠进行超声心动图检测,评估左心室功能的变化。第28天对各组大鼠进行取材(1)通过心肌酶学检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量;血流动力学和高分辨率小动物超声影像系统考察心室壁运动的改善作用以及左心室收缩舒张功能的变化;(2)通过HE、MASSON的病理学分析,考察药物对心脏形态及结构的影响;(3)通过对CX43(缝隙连接蛋白43)表达的影响,考察药物对心肌组织的电导和机械耦合效应;通过对ANP(心钠肽)表达的影响,考察药物对心肌组织的特异性效应;通过对心肌组织梗死边缘的α-SMA(血管平滑肌细胞标记物)进行了血管生成表达的分析,考察药物对新血管生成的改善作用;(4)通过对相关基因CX43、α-SMA、TNF-α、Ang-1、VEGF、c Tn T的验证,考察药物对心肌组织内部的影响作用。3通过分子生物学技术,对心肌组织TUNEL荧光染色以检测心脏凋亡的情况;利用Western Blot检测心肌组织Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyt-c以及Cleaved caspase-3的表达;利用Western Blot检测各组心肌缺血损伤大鼠组织中JNK/MAPK通路相关蛋白的表达含量,从而表明黄芪甲苷负载HB(PEG-PBA)/HA-SH/GNRs导电水凝胶通过抑制心肌纤维化、减少心肌细胞凋亡等途径改善心脏功能,探讨药物的可能作用机制。研究结果1利用中药化学合成方法合成超支化聚合物HB(PEG-PBA),进而与4-乙烯基苯硼酸HA-SH进行化学反应,并制备中药黄芪甲苷纳米微球溶液,并掺杂纳米金颗粒,将这三部分进行化学交联反应,通过化学键间的结合,PBA与黄芪甲苷上的氢键成功对接,增强水凝胶的载药量,从而制得黄芪甲苷负载的HB(PEG-PBA)/HA-SH/GNRs导电水凝胶。通过对其释放性能检测发现具有药物缓释释放性能,结果显示该水凝胶具有一定的实用性、低毒性、无害性,可以应用于心脏。2通过向心肌梗死模型大鼠的心肌梗死边缘区处注射黄芪甲苷负载HB(PEG-PBA)/HA-SH/GNRs导电水凝胶,结果显示药物干预后左室功能得到改善;并降低缺血损伤大鼠中LDH、CK、CK-MB的含量;HE和MASSON染色结果显示:黄芪甲苷负载HB(PEG-PBA)/HA-SH/GNRs导电水凝胶能降低炎症细胞浸润,抑制心肌纤维化,减少心室重塑,延缓心室重构。进一步通过对CX43、ANP和α-SMA的免疫荧光分析,结果显示心肌组织的心肌电活动得到药物干预后有所提高、心功能得到改善;对CX43、ANP、α-SMA、VEGF、Ang-1以及c Tn T的基因层面的探究也得到证实。3 TUNEL荧光染色及Western Blot检测心肌组织Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyt-c、Cleaved caspase-3以及JNK/MAPK通路相关蛋白表达含量,证实黄芪甲苷负载HB(PEG-PBA)/HA-SH/GNRs导电水凝胶具有抗凋亡的作用。研究结论通过上述研究,明确了黄芪甲苷负载的HB(PEG-PBA)/HA-SH/GNRs导电水凝胶具有改善心肌梗死模型大鼠的心脏功能、抑制心肌纤维化、延缓心室重构和增强心脏的导电性,其作用机制可能与JNK/MAPK凋亡信号通路有关。