【摘 要】
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植物microRNA(miRNA)是一类由植物基因组DNA转录,经加工成熟后,对靶基因有沉默功能的非编码单链小RNA。为了筛选到响应水稻非生物胁迫的miRNAs,本论文通过文献查询、数据库筛
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植物microRNA(miRNA)是一类由植物基因组DNA转录,经加工成熟后,对靶基因有沉默功能的非编码单链小RNA。为了筛选到响应水稻非生物胁迫的miRNAs,本论文通过文献查询、数据库筛选和生物信息学分析,获得了与水稻非生物胁迫相关的miRNAs。对野生型日本晴水稻分蘖期植株分别进行高温(50℃)胁迫、干旱(10%PEG6000模拟)胁迫、低温(6℃)胁迫和盐(100 m M)胁迫处理,qRT-PCR表达分析获得了与水稻高温、干旱、低温和盐胁迫相关的miRNAs,成功构建了Osa-microRNAs过表达载体pOsa-miRNAs-OE和干扰载体pOsa-mi RNAs-STTM,用于后续的Osa-mi RNAs基因功能研究。(1)数据库筛选和生物信息学分析:经miRNAs转录组数据库筛选和文献查阅,构建了一个与水稻逆境相关的miRNAs文库。对文库中的miRNA进行上游启动子顺式元件分析,预测结果显示,预选Osa-miRNAs上游启动子区间均有与水稻逆境胁迫相关的顺式作用元件。(2)qRT-PCR验证:通过茎环法对水稻miRNAs进行反转录,以水稻U6为内参基因,用SYBR Green?染料法进行qRT-PCR。结果表明,水稻mi RNAs在不同非生物胁迫条件下有表达量的差异,依据筛选出了响应水稻非生物胁迫的miRNAs。水稻miRNAs在根和叶的表达量存在差异,说明miRNAs在水稻植株中存在空间表达差异。(3)构建Osa-miRNAs过表达载体和STTM干扰载体:以Osa-miRNA1876为例,通过引物合成接头法和基因组扩增法,获得了Osa-pre-miRNA1876的基因序列,整合到植物表达载体pCAMBIA1300-ubi中,获得Osa-pre-miRNA1876过表达载体pOsa-mi RNA1876-OE;以Osa-miRNA1876成熟序列,设计两个靶基因靶点模拟物,分别连在48 nt发夹结构5′端和3′端,获得Osa-miRNA1876 STTM功能片段,整合到植物表达载体pCAMBIA1300-ubi中,获得Osa-miRNA1876干扰载体pOsa-mi RNA1876-STTM。
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