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iNKT(invariant natural killer T)细胞是一类同时具有T细胞和NK细胞表型及功能特征的固有免疫样T细胞亚群,可识别CD1d分子提呈的脂类抗原。活化以后,iNKT细胞通过快速分泌多种细胞因子及直接杀伤效应,在抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用。然而现有研究主要局限在小鼠iNKT细胞的抗瘤效应,对人iNKT细胞的特性及抗瘤效应认知极少。尤其在人iNKT细胞对T细胞源性肿瘤细胞的效应特点以及其在抗T淋巴瘤中的潜在应用价值尚属未知。为了扩展对人iNKT细胞特性及其抗肿瘤效应的认知,本研究选择3种外周血单个核细胞(T细胞/B细胞/单核细胞)以及5种肿瘤细胞(包括3种血液系统肿瘤细胞系:T细胞来源的Jurkat细胞,B细胞来源的721.221细胞,髓系红白血病细胞K562细胞;2种实体瘤细胞系:前列腺癌细胞PC-3和肝癌细胞Hep G2)作为刺激细胞或靶细胞,研究人iNKT细胞对不同刺激细胞/肿瘤细胞差异性应答的特征与机制。并通过T淋巴瘤患者体内CD1d的表达与iNKT细胞功能状态的解析,探索iNKT细胞在T淋巴瘤中的应用潜能及可能干预策略。论文分为了三部分,主要内容与结果如下:一.人iNKT细胞的体外扩增及其对不同抗原提呈细胞的差异性应答我们通过收集健康个体的外周血,分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),并应用α-Gal Cer体外刺激结合PBS57/CD1d四聚体分选,建立了人iNKT细胞体外扩增体系与分选方法。同时分选外周血中单核细胞,B细胞和T细胞作为刺激细胞,刺激富集的初始iNKT细胞和α-Gal Cer扩增的iNKT细胞,分析其分泌的细胞因子水平。结果显示,单核细胞对iNKT细胞的刺激能力最强,可刺激初始iNKT细胞与α-Gal Cer扩增的iNKT细胞分泌Th1型细胞因子(IFN-γ与TNF-α),并且可作为PBMC中α-Gal Cer主要的抗原提呈细胞促进iNKT细胞体外扩增。另外,B细胞对初始iNKT细胞激活作用较弱,但可刺激α-Gal Cer扩增的iNKT细胞分泌适量Th1型细胞因子。T细胞刺激能力最弱,无法诱导iNKT细胞产生Th1型细胞因子。所有组别iNKT细胞分泌的Th2型细胞因子(IL-4与IL-10)水平普遍很低。这些结果说明人iNKT细胞的功能以Th1型效应为主,对不同刺激细胞产生强度不同的细胞因子分泌效应。二.人iNKT细胞对不同肿瘤细胞表现出差异性细胞因子应答与细胞毒效应本部分研究通过T细胞来源的Jurkat细胞,B细胞来源的721.221细胞,髓系红白血病细胞K562,前列腺癌细胞PC-3以及肝癌细胞Hep G2等不同来源的肿瘤细胞系,研究人iNKT细胞对不同肿瘤细胞的效应。其中仅T细胞来源的Jurkat细胞高表达CD1d分子,而其他细胞系几乎不表达CD1d分子。为了让不同来源的肿瘤细胞相对均一的高表达CD1d,我们构建CD1d表达质粒转入不同细胞系,并筛选高表达CD1d分子的转染株作为刺激细胞。结果提示,人iNKT细胞对不同肿瘤细胞表现出差异性的细胞因子分泌效应。其中,实体瘤细胞(PC-3与Hep G2)可诱导iNKT细胞最强的抗瘤细胞因子分泌,而Jurkat细胞刺激的iNKT细胞表现出抗瘤细胞因子分泌障碍。同时人iNKT细胞对不同肿瘤细胞的杀伤强度及杀伤机制不同。iNKT细胞对Jurkat细胞的细胞毒效应最强并主要依赖于Fas介导的靶细胞凋亡,而对其他细胞株的杀伤效应主要通过穿孔素与颗粒酶B途径。另外,iNKT细胞对不同来源的靶细胞的杀伤效应均具有CD1d依赖性。这些研究结果说明人iNKT细胞对不同肿瘤细胞表现出差异性细胞因子应答与杀伤效应,其中对Jurkat细胞发挥免疫应答时,表现出低抗瘤细胞因子分泌但是强细胞毒效应的应答特点。三.人iNKT细胞抗T淋巴瘤的应用潜能研究本部分研究发现,人iNKT细胞对Jurkat细胞的不平衡的细胞因子/细胞毒效应与Fas/Fas L的作用密切相关,Fas/Fas L的交互作用不仅介导Jurkat细胞的凋亡,也可导致Fas L表达的iNKT细胞细胞因子分泌障碍。通过给予外源性IL-2刺激后,可以显著增加iNKT细胞IFN-γ的产生,并且不影响iNKT细胞对Jurkat细胞的杀伤作用。另外,对18例T淋巴瘤组织CD1d检测显示T淋巴瘤组织CD1d分子普遍高表达,提示iNKT细胞具有抗T淋巴瘤的潜能。但是对患者外周血iNKT细胞数量与功能检测发现,患者体内iNKT细胞比例显著减少,并且细胞因子分泌功能缺陷和增殖功能低下。外源性的IL-2可以部分逆转T淋巴瘤患者的iNKT细胞功能缺陷,增强患者iNKT细胞经α-Gal Cer刺激后的增殖与IFN-γ的分泌能力。总的来说,IL-2与α-Gal Cer的联合应用有望增加患者体内iNKT细胞的数量并增强其功能。鉴于T淋巴瘤患者CD1d分子上调表达,基于iNKT细胞的干预策略在抗T淋巴瘤方面具有潜在应用价值。本研究的结论和意义:1.iNKT细胞对不同刺激细胞/肿瘤细胞表现出差异性的细胞因子应答与杀伤效应。2.Jurkat细胞及T淋巴瘤组织CD1d高表达提示iNKT细胞在恶性T细胞疾病中的应用潜能,但是iNKT细胞对T细胞来源的Jurkat细胞发挥免疫应答时,表现出低抗瘤细胞因子分泌与强细胞毒效应的不平衡应答特点。3.外源性的IL-2可以增强iNKT细胞针对Jurkat细胞的抗瘤细胞因子分泌,并且逆转T淋巴瘤患者的iNKT细胞功能缺陷,提示基于iNKT细胞的干预策略在治疗T淋巴瘤中具有应用前景。本研究的创新点:1.本研究揭示了iNKT细胞对T细胞来源的Jurkat细胞表现出细胞因子与杀伤效应分离的独特应答特点,而且这种效应特点具有CD1d依赖性并主要与Fas/Fas L途径密切相关。2.本研究探索了多例T淋巴瘤患者体内淋巴组织CD1d水平及iNKT细胞的功能状态,并提示iNKT细胞在T淋巴瘤方面的潜在应用价值及干预策略。