B细胞连接蛋白(BLNK)是在脊椎动物B淋巴细胞和巨噬细胞中广泛表达的一类蛋白质,在进化上高度保守,参与调节B淋巴细胞内信号传导、增殖、分化、凋亡等进程,对于生物体维持正常生命活动起关键作用。七鳃鳗作为无颌类脊椎动物的代表,拥有着最古老的适应性免疫防御机制。对无颌类脊椎动物的研究将为适应性的免疫起源奠定坚实的理论基础。目前关于BLNK的研究多集中在哺乳动物,在七鳃鳗中是否存在BLNK尚不明确。本论文利用分子生物学手段和生物信息学方法,从现存最古老的无颌类脊椎动物七鳃鳗(Lampetra japonica)血液cDNA文库中搜索到一条BLNK同系物,对其基因进行克隆和表达分析,有助于从分子水平上阐述脊椎动物BLNK蛋白的起源和进化关系。本研究通过对日本七鳃鳗血液cDNA文库3382条有效EST序列进行生物信息学分析,发现一条能够翻译BLNK保守区SH2结构的核苷酸序列,长594 bp。通过RACE的实验方法从日本七鳃鳗白细胞中成功扩增BLNK cDNA全长并将保守区克隆到pET32a(+)载体。从一级结构比对、高级结构预测、保守基序的分布、等方面分析了这段序列。七鳃鳗BLNK不含有信号肽和跨膜区。为了进一步说明七鳃鳗BLNK与其它脊椎动物BLNK的亲缘关系,构建基于邻接法的系统发育树,从进化树中发现脊椎动物BLNK基因大致分为两三簇,哺乳动物与鸟类、爬行类动物一簇,硬骨鱼类在一簇,两栖类与七鳃鳗在一簇。此外,对七鳃鳗BLNK进化地位进行分析,发现七鳃鳗BLNK进化地位比较原始,符合生物由低等到高等的客观自然进化规律。利用基因工程手段,设计特异性引物,以GAPDH作为内参基因,Real-time PCR法检测BLNK基因在七鳃鳗心脏、肝脏、肾脏、鳃、肠和白细胞中的相对表达量,发现在BLNK在七鳃鳗上述组织中广泛表达,进一步经脂多糖(LPS)与植物凝集素(PHA)刺激后, BLNK在白细胞与心脏中的表达量明显上调,具有统计学意义。以上结果说明BLNK参与类B淋巴细胞免疫应答,抵御外来物质的入侵发挥着重大作用。进一步构建pET32a- BLNK原核表达载体,并在E.coli BL21中进行表达,组氨酸亲和层析,获取七鳃鳗BLNK重组蛋白(recombinant L. japonica BLNK,rLj- BLNK)纯品。以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰兔和BALB/c小鼠,制备兔抗七鳃鳗血清BLNK蛋白多克隆抗体和鼠抗七鳃鳗血清BLNK蛋白多克隆抗体。综合上述的研究结果得出:在最原始的脊椎动物七鳃鳗中存在B细胞连接蛋白(BLNK),它具体参与的信号转导途径尚不明确。