论文部分内容阅读
家蚕（Bombyx mori）是鳞翅目的代表昆虫,同时也是具有重要经济价值的泌丝昆虫。丝腺是家蚕唯一的泌丝器官,它能够高效地合成和分泌丝蛋白。家蚕丝蛋白包括丝素蛋白与丝胶蛋白。丝素蛋白由后部丝腺（PSG）合成分泌,丝胶蛋白由中部丝腺（MSG）合成分泌,丝胶蛋白主要包括丝胶蛋白1（Ser1）、丝胶蛋白2（Ser2）和丝胶蛋白3（Ser3）。家蚕的茧丝主要由两根丝胶蛋白在外包裹丝素蛋白的纤维。丝蛋白作为家蚕最重要且最有价值的研究热点之一,也一直受到人们的关注。随着科技的进步与发展,丝蛋白相关材料也被运用到诸多科学领域中。过去由于缺乏家蚕丝胶抗体,所以在蛋白水平上检测丝胶蛋白的表达以及利用丝胶抗体进行检测应用等方面都至今未有报道。所以本实验通过合成多肽制备家蚕丝胶抗体,将其运用到基础实验与应用研究中,充分发挥利用家蚕丝胶抗体的潜在应用价值,主要获得以下研究结果:1、成功制备出多个不同的家蚕丝胶抗体本实验首先从NCBI数据库中检索出家蚕丝胶基因Ser-1B、Ser2-2和Ser3-2氨基酸序列,根据抗体设计软件,选择了7条多肽进行合成,并制备抗体。利用Elisa实验检测抗体效价,所有抗体效价均达到1:80000以上。以多肽抗原对抗体进行特异性识别检测后,最终筛选出6个特异性良好的丝胶抗体分别为:Ser1-1、Ser1-2、Ser2-1、Ser2-3、Ser3-1和Ser3-2。2、家蚕丝胶抗体的特异性鉴定家蚕丝胶蛋白在家蚕中部丝腺（MSG）的不同部位表达,为了对丝胶蛋白抗体进行特异性鉴定,首先对家蚕872品系5龄5天幼虫中部丝腺前部（A-MSG）,中部丝腺中部（M-MSG）及中部丝腺后部（P-MSG）的内容物进行了免疫杂交实验。结果显示Ser1的抗体在872的M-MSG和P-MSG分别检测到了两条免疫条带,在A-MSG没有检测到免疫条带,结果表明在该时期Ser1只在M-MSG与P-MSG中表达,这与目前Ser1基因在M-MSG及P-MSG表达的结果类似。Ser2的抗体仅在A-MSG中检测到两条免疫条带。Ser3抗体在A-MSG与M-MSG中检测到信号,P-MSG中未检测到信号。上述结果均与丝胶基因在核酸水平上的报导一致。随后对家蚕872品系5龄7天幼虫不同部位的MSG进行了免疫荧光实验,结果显示Ser1抗体在A-MSG的丝胶层、M-MSG和P-MSG的丝胶层与细胞层检测到了荧光信号;Ser2抗体只在A-MSG的丝胶层和细胞层检测到了荧光信号;Ser3抗体在A-MSG的丝胶层和M-MSG的细胞层检测到了信号,在P-MSG中未检测到信号。上述结果与Western blot的结果一致,最终我们对这些丝胶抗体完成鉴定,表明其可用于后续的应用实验。3、利用家蚕丝胶抗体观察丝蛋白分泌过程利用制备的特异性丝胶抗体,观察丝胶蛋白的动态分泌过程。对家蚕872品系5龄7天幼虫A-MSG、M-MSG和P-MSG进行石蜡切片。经HE染色后,发现A-MSG的丝胶层分布情况较为丰富,所以对该部分挑选了I、II、III共3个区域进行详细的观察。对切片进行免疫组化探究丝胶层中丝胶蛋白的分布情况,Ser1抗体在II区域的丝胶层仅检测到少量信号。Ser2抗体的信号在I区域细胞层与丝胶层被检测到,在II、III区域内的丝胶层可以检测到Ser2抗体的信号。Ser3抗体的信号三个区域的细胞层与丝胶层被检测到。M-MSG切片经HE染色后观察到结构较为类似,所以只选出一个区域的切片进行免疫组化,Ser1抗体与Ser3抗体在细胞层与丝胶层检测到信号,Ser2抗体未检测到信号。同样P-MSG的切片也只选出I区域的切片,在细胞层与丝胶层中仅检测到Ser1抗体的信号,本部分得出的总体结果与先前报导的核酸水平上丝胶基因的表达结果一致,除此之外发现在该时期Ser2蛋白在A-MSG的前端表达,Ser3蛋白在A-MSG的中后端表达。4、家蚕绵茧突变体Fl丝胶基因及丝胶蛋白分析家蚕绵茧突变品系Fl其茧壳蓬松多层,与正常家蚕所结的致密茧壳差异很大。根据先前的研究报道称可能是绵茧茧层之间的粘附层出现问题导致其表型,目前报道丝胶蛋白在蚕茧形成过程中起到关键作用,所以针对绵茧突变体Fl与致密茧872品系进行了调查。首先在蛋白水平上进行检测,对Fl和872的茧壳进行蛋白质组分析,结果表明Fl茧壳中的Ser3蛋白含量高于872且具有显着性差异。取相同质量的Fl和872的茧壳进行Western blot实验,结果显示Fl中Ser3抗体信号强度高于872,这与蛋白质组结果一致。随后在m RNA水平上对丝腺腔中丝胶基因的表达进行分析,值得关注的是Fl和872的A-MSG中Ser1基因在Fl中有表达,在872中没有表达。在Fl和872的P-MSG中,Ser3基因在Fl有一定的表达,而在872中没有表达,且Ser3基因在Fl的A-MSG、M-MSG与P-MSG中的表达量较高。最终我们推测可能是由于绵茧的Ser1基因与Ser3基因的表达紊乱或Ser3基因的表达量过高造成其茧型疏松多层的表型。5、家蚕丝胶抗体鉴别不同蚕丝及丝织品蚕茧的后期加工主要包括烘茧-缫丝-脱胶等过程。在这过程中,丝胶蛋白在每一步发生了什么变化目前并不清楚,本研究对不同生产过程的茧丝进行了丝胶蛋白的检测。选取秋二茧壳、生丝、熟丝和白丝绸进行实验,以872品种的蚕茧做对照。称取相同质量的材料完全溶解后进行Western blot实验,结果表明Ser1与Ser3抗体在872茧壳、秋二茧壳、生丝及熟丝中均检测到了信号。Ser2抗体在上述材料中未检测到信号。在生丝到熟丝这一过程中,Ser1抗体信号减弱很多,在这一过程中主要脱去的是Ser1蛋白。在秋二茧壳到生丝这一过程中,Ser3抗体信号出现明显减弱,表明这一过程中主要脱去的是Ser3蛋白,表明脱胶过程中先脱去外层的Ser3蛋白再脱去内层的Ser1蛋白。Fib-L抗体的信号在秋二茧壳、生丝及熟丝中是逐渐增强的,可以得出随着蚕茧加工程度加深,丝胶不断的被逐级脱掉。综上所述,本研究成功制备了6个丝胶蛋白的抗体,不仅可用于家蚕丝蛋白的分泌过程的基础研究,而且还可应用在工业上的丝胶脱胶过程中的检测。