目的：高血压病被世界卫生组织认定为导致心血管疾病患者死亡的主要因素,其多种机制都跟高血压患者的外周血管阻力增高有关。大量证据显示肾脏的水盐代谢功能紊乱(尤其是肾脏内的肾素-血管紧张素-醛固酮系统功能失调)和／或交感神经系统功能紊乱是高血压病发生发展的重要因素。管球反馈(Tubuloglomerular glomerular feedback, TGF)是调节肾脏微循环和肾脏血流动力学的重要机制,通过调节肾小球入球小动脉的收缩与舒张,改变肾小球的滤过率(Glomerular filtrationrate, GFR)。而肾脏致密斑(Macula densa,MD)细胞可以通过释放一氧化氮(Nitric oxide,NO)而减弱TGF,使肾小球入球小动脉舒张而增加GFR。而同样来源于MD的超氧化物(Super oxide, O2-)则可以使NO失活,TGF加深,最终减少GFR。但它们之间的相互作用以及它们跟TGF之间的具体作用还不明了。TGF受多种因素调节,包括血管紧张素Ⅱ、腺苷、花生四烯酸代谢物、ATP、心房利钠因子、NO和O2-等等。最近,我们发现由肾上腺皮质球状带分泌的盐皮质激素——醛固酮在TGF反应中也有重要的作用。蛋白激酶C (Protein Kinase C, PKC)是一种调节机体对类固醇激素急性反应的信号转导蛋白。PKC被证明在多种类型细胞上醛固酮诱导的信号通路中是一种重要的中介物。但是PKC信号通路在致密斑细胞上醛固酮的促氧化作用中是否有作用还不知道。本论文的实验思路是：同时应用体外培养细胞与应用分离和微灌注球旁器(Juxtaglomerular apparatus, JGA)技术在活体组织中证明,在肾脏致密斑中醛固酮能够刺激超氧化物产生,从而消除一氧化氮,进而抵消一氧化氮对管球反馈的抑制作用。同时还研究PKC在醛固酮刺激超氧化物产生过程中的作用。第一部分：醛固酮刺激致密斑细胞产生一氧化氮和超氧化物材料与方法实验细胞系本实验中所使用的细胞为MMDD1(Macula dense like cell line)细胞系,由美国国立卫生院的Dr J. Schnermann提供,这种细胞系是由具有致密斑细胞特性的肾小管上皮细胞系培育而成。为确保细胞处于较好的活性状态,只选用孵育至21-25代的MMDD1细胞。一氧化氮的检测使用荧光检测法检测MMDD1细胞中生成NO的量。操作步骤主要为选用生长面积达到70%-80%的细胞,加入能渗透细胞膜的一氧化氮指示剂4,5-diaminofluorescein diacetate(DAF-2DA),作为荧光染料,将其溶于0.5%的dimethyl sulfoxide (DMSO)溶液,浓度为10umol/L,作用细胞30min后,使用荧光显微镜检测荧光,计算NO产量,然后加入或者不加入醛固酮作用15min然后再检测NO产量。超氧化物的检测使用Lucigenin增强化学发光法检测MMDD1细胞中生成O2-的量。操作步骤主要为,选用生长面积达到70%-80%的细胞,用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution, PBS)冲洗细胞两次,加入1mL胰酶消化1-2min,5ml Krebs/Hepes缓冲液中和,离心,去上清后,加入12mL Krebs/Hepes缓冲液制备细胞悬浊液。通入氧气,加入NAD(P)H,然后加入Lucigenin,加入或者不加入醛固酮后37℃水浴30min,然后分别上机检测。分离和微灌注球旁器应用跟以前报道的相似的分离和微灌注技术来处理入球小动脉(Afferent glomerular arteriole, Af-Art)(?)(?)附着的致密斑。取雄性新西兰大白兔(1.5到2.0kg)用氯胺酮麻醉(45mg/kg,腹腔注射)。游离取下肾脏沿纵轴切片。通过立体显微镜显微分离皮质内的肾小球及入球小动脉、伴随的髓袢升支粗段、致密斑还有远端小管起始端。分离完成后将其转移到倒置显微镜中具备温度调节功能的载物台上。然后入球小动脉和远端肾小管起始端或者髓袢升支粗段插入玻璃毛细管装置。显微分离和微灌注要在8℃下60min以内完成。然后标本被转移到倒置显微镜的载物台上并浸入保持37℃的MEM溶液中完成剩余的实验。在检测前可以等待30min的稳定期。检测被灌注的致密斑中超氧化物的产生选用对超氧化物敏感的荧光染料——dihydroethidium(二氢乙啶)来检测超氧化物的含量水平。髓袢升支粗段持续灌注,致密斑细胞浸入含有二氢乙啶的MEM溶液中结合30min然后冲洗10min。致密斑细胞在380/490nm光线下照射来激活dihydroethidium和oxyethidium(氧乙啶)。收集并计算oxyethidium对dihydroethidium的比值变化作为超氧化物产量的指标。先前发现增加灌注液中氯化钠和醛固酮的浓度能促进致密斑中一氧化氮的释放,所以在MEM浸液跟致密斑灌注液中加入一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)的拮抗剂N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)来消除测量超氧化物的过程中一氧化氮对其影响。为了证明致密斑中醛固酮所诱导产生的超氧化物有时间依赖性,在含有L-NAME的灌注液中加入10-7mol/L的醛固酮,然后每间隔15min检测超氧化物的量,共检测75min。统计分析采用了t检验,单因素方差分析(ANOVA)和post-hoc Fisher LSD检验对实验所得数据进行统计分析,数据均采用均数±标准差表示,P<0.05被视为有统计学意义。结果醛固酮刺激MMDD1细胞产生一氧化氮实验组基础值是40.4±4.3U/min,加入醛固酮刺激15mmin后升为644.1±118.5U/min,而在对照组中,基础值是45.9±5.2U/min,15min后为53.4±6.1U/min。醛固酮刺激MMDDI细胞产生超氧化物没有醛固酮处理的对照组基础值是1293±106RLU·s-1.105cells-1,有醛固酮处理细胞的实验组,升为2349±222RLU·s-1.105cells-1。醛固酮在分离灌注的致密斑中刺激超氧化物的产生将致密斑的灌注液中氯化钠(NaCl)浓度从10mmol/L升至80mmol/L,然后用10-8或者10-7mol/L的醛固酮刺激15min,并没有发现超氧化物的产生有明显变化。推测是致密斑中由醛固酮诱导产生的一氧化氮对超氧化物产生了影响,为了消除一氧化氮的影响,在后续实验中检测超氧化物时向致密斑浸液和灌注液中加入10-4mol/L L-NAME。用NaCl(80mmol/L)灌注致密斑时,超氧化物量为9.4±1.5U/min。在灌注液中加入醛固酮(10-7mol/L)刺激15mmin,超氧化物产量增加到17.2±1.3U/min。加入醛固酮(10-8mol/L)对一氧化氮产生没有明显影响。在含有L-NAME的灌注液中加入醛固酮(10-7mol/L),每间隔15mmin检测超氧化物,共检测75mmin。结果显示,致密斑中超氧化物的量随时间延长而逐渐增加。结论醛固酮能刺激MMDD1细胞产生一氧化氮和超氧化物,同时在分离并微灌注的活体组织致密斑上醛固酮能增加超氧化物的产生第二部分醛固酮诱导产生的一氧化氮和超氧化物的相互作用以及对管球反馈的影响材料与方法分离和微灌注球旁器同第一部分。检测一氧化氮和超氧化物的相互作用对管球反馈的影响将显微分离的致密斑转移到倒置显微镜中具备温度调节功能的载物台上并采用NaCl (10mmol/L)灌注等待30min稳定期后,换用NaCl (80mmol/L)灌注液,检测入球小动脉管腔十径5min。再换回NaCl (10mmol/L)的灌注溶液,藉由入球小动脉前后直径的变化反映管球反馈效应的改变。将醛固酮加入肾小管的灌注液中灌注15mmin然后检测管球反馈效应的改变,以此反映醛固酮在管球反馈调节过程中的作用。为了检测超氧化物的清除剂哌啶(tempol)对管球反馈效应的影响,向小管灌注液中加入超氧化物清除剂哌啶灌注15min然后检测管球反馈效应的改变。为了确定哌啶在管球反馈中的影响是否具有持续性,换回含有lOmmol/L NaCl的灌注液并重复上述实验。为了检测致密斑中超氧化物的清除对醛固酮诱导的管球反馈的反应性降低是否有作用,同时向小管灌注液中加入超氧化物清除剂哌啶(tempol)和醛固酮灌注15min然后检测管球反馈效应的改变。检测醛固酮诱导致密斑产生超氧化物的信号通路为了证明醛固酮诱导超氧化物的产生是否通过PKC调节,采用PKC的抑制剂并且重复上面分离微灌注致密斑的实验。将PKC的非特异性抑制剂Chelerythrine chloride (CC)加入含有80mmol/L NaCl的灌注液中灌注致密斑30min,检测超氧化物的产量。然后在灌注液中加入10-7mol/L的醛固酮刺激15min,并检测超氧化物的产量。为了证明醛固酮诱导超氧化物的产生是否通过PKCa调节,采用PKCa抑制剂并且重复上面分离微灌注致密斑的实验。将PKCa特异性抑制剂Go10-7mol/L加入含有80mmol/L NaCl的灌注液灌注致密斑30min。检测超氧化物的产量。然后在灌注液中加入10-7mol/L的醛固酮刺激15min,并检测超氧化物的产量。统计分析采用了t检验,单因素方差分析(ANOVA)和post-hoc Fisher LSD检验对实验所得数据进行统计分析,数据均采用均数±标准差表示,P<0.05被视为有统计学意义。结果致密斑中超氧化物的消除进一步增强醛固酮在管球反馈中的作用首先测定了基础值,当灌注液中NaCl的勺含量从10mmol/L升到80mmol/L时,入球小动脉管腔直径从17.5±0.5um降到了15.1±0.5umn,管球反馈为2.4±0.3umn。将10-7mol/L的醛固酮加入灌注液中灌注15min,当灌注液中NaCl的含量从10mmol/L升到80mmol/L时,入球小动脉的管腔直径从17.6±0.5um降到了16.1±0.6um,管球反馈降为1.4±0.2um将10-4mol/L的哌啶加入灌注液中灌注15min,当灌注液中NaCl的含量从1Ommol/L升到80mmol/L时,入球小动脉管腔直径从17.2±0.5um降到了15.6±0.4um,管球反馈为1.5±0.2um。重复上述实验,将灌注液中NaCl的含量从10mmol/L再次升到80mmol/L,入球小动脉管腔直径显示从17.3±0.6um降到了15.8±0.7um,管球反馈为1.4±0.2um。将10-4mol/L的哌啶和10-7mol/L的醛固酮同时加入灌注液中灌注15min,将灌注液中NaCl的含量从10mmol/L升到80mmol/L时,入球小动脉管腔直径从18.4±0.6um降到了18.1+0.7um,管球反馈为0.4+0.2um。醛固酮刺激超氧化物产生过程是由PKC α信号通道介导将PKC的非特异性抑制剂CC10-7mol/L加入含有80mmol/L NaCl的灌注液灌注致密斑30min。超氧化物的产量为7.3+1.1U/min.然后在灌注液中加入10-7mol/L的醛固酮刺激15min,超氧化物的产量为5.9+1.7U/min。将PKCα的特异性抑制剂Go10-7mol/L加入含有80mmol/L NaCl的灌注液灌注致密斑30min。超氧化物的产量为7.9±1.2U/min.然后在灌注液中加入10-7mol/L的醛固酮刺激15min,超氧化物的产量为6.3±1.5U/min。结论首次应用分离和微灌注球旁器技术在活体组织中进一步证明,醛固酮诱导超氧化物的产生增加能够抵抗致密斑中一氧化氮对管球反馈的影响,从而调节管球反馈的反应性；而且PKC α在调节致密斑中醛固酮诱导的超氧化物产生增加的过程中有重要作用。意义与本实验室以往进行的体外实验相比,该体内实验有助于进一步了解肾脏致密斑中醛固酮引起的一氧化氮和超氧化物的产生及相互作用对管球反馈的影响,进而影响肾脏的水盐代谢及血流动力学变化,从而对血压产生影响等机制,明确其在心脏、肾脏等高血压相关靶器官损伤中的作用,为临床治疗提供新的干预靶点,对临床工作给予积极指导。