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【目的】
1.建立内皮细胞缺氧复氧(HR)模型，验证课题组前期实验结果：lncRNA3901在HR诱导HUVEC细胞凋亡中表达上调；lncRNA3901表达上调促进DAXX细胞质转移，激活Fas/DAXX/ASK1/JNK通路诱导细胞凋亡。
2.探讨lncRNA3901对SUMO1/DAXX信号通路的调控作用，进一步阐明lncRNA3901调控缺氧复氧诱导内皮细胞凋亡的分子机制。
【方法】
实验用人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)建立缺氧复氧模型，模拟体内缺血再灌注损伤，将正常培养的HUVEC培养至80%的密度时，换用无糖和无血清的培养基后放置于密封的缺氧小室(Chamber)中，充入低氧三元气体(94%N2、5%CO2、1%O2)，并将缺氧小室放入37℃恒温箱培养12h，然后将培养基换为完全培养基，继续正常培养8h。(1)首先验证HR诱导内皮细胞凋亡，并激活Fas/DAXX相关信号通路。流式细胞术检测细胞凋亡率；免疫荧光实验和WesternBlot检测DAXX核质分布水平；WesternBlot检测DAXX、Fas通路以及凋亡相关蛋白的表达水平。(2)RT-PCR验证HR模型中lncRNA3901的表达水平；敲低、过表达lncRNA3901，检测lncRNA3901差异表达对DAXX胞内分布的调控，以及对HR诱导细胞凋亡的影响。(3)利用FISH实验分析lncRNA3901亚细胞定位；通过RNAPull-down实验、生物质谱和RNA免疫沉淀(RIP)技术筛选并验证lncRNA3901与SUMO1蛋白相结合。(4)利用CO-IP实验验证HR诱导DAXX蛋白SUMO化水平的变化；敲低SUMO1，观察DAXX蛋白SUMO化水平改变与DAXX核质分布改变的关系，以及敲低SUMO1对HR诱导细胞凋亡的影响。(5)敲低、过表达lncRNA3901，利用CO-IP检测lncRNA3901表达差异对DAXXSUMO化水平的影响；将SUMO1表达质粒共转染至lncRNA3901过表达细胞系，观察SUMO1表达上调对lncRNA3901过表达诱导的细胞凋亡的影响。
【结果】
1．HR激活DAXX/ASK1通路诱导内皮细胞凋亡。流式结果显示，HR可以诱导内皮细胞调亡，使用JNK抑制剂SP600125预处理能减少HR诱导的细胞凋亡；免疫荧光实验和核质分离WesternBlot结果显示，NC组细胞中DAXX主要在细胞核内分布，HR处理能显著诱导DAXX转移至细胞质中。WesternBlot结果显示，HR组细胞的BAX、cleaved-caspase3等凋亡相关蛋白表达增加，同时HR组Fas、p-ASK1、p-JNK等Fas通路蛋白水平明显上调。
2．lncRNA3901在HR处理的内皮细胞中表达上调。敲低lncRNA3901可抑制DAXX细胞质分布、抑制Fas通路激活，同时减少HR诱导的细胞凋亡；过表达lncRNA3901能促进HR诱导的DAXX细胞质分布和内皮细胞凋亡。
3．FISH实验表明lncRNA3901在细胞质中丰富表达，RNAPull-down实验联合蛋白质谱分析筛选，以及RIP实验反向证实lncRNA3901与SUMO1蛋白相结合。进一步行deletedmapping实验发现，lncRNA3901的5’端1-250碱基序列是与SUMO1特异性结合的必须片段。
4．SUMO1调节DAXXSUMO化修饰水平：在HR诱导内皮细胞凋亡模型中，SUMO1结合蛋白的表达水平显著降低；同时CO-IP实验证实HR可以抑制DAXXSUMO化修饰。敲低SUMO1能增加HR诱导的DAXX细胞质转移，从而促进HR诱导细胞凋亡。
5．lncRNA3901调控DAXX的SUMO化水平：根据CO-IP和WesternBlot结果，敲低lncRNA3901时，HR对DAXXSUMO化抑制作用减少，细胞质中DAXX表达水平下降；过表达lncRNA则进一步增加HR对DAXXSUMO化抑制作用，细胞质中DAXX表达增多。而在细胞功能回复实验中，共转染过表达SUMO1可逆转过表达lncRNA3901后HR诱导的内皮细胞凋亡。
【结论】
lncRNA3901通过结合SUMO1，抑制SUMO1介导的DAXX蛋白SUMO化修饰，从而促进DAXX细胞质转移，进而促进HR诱导的内皮细胞凋亡。
1.建立内皮细胞缺氧复氧(HR)模型，验证课题组前期实验结果：lncRNA3901在HR诱导HUVEC细胞凋亡中表达上调；lncRNA3901表达上调促进DAXX细胞质转移，激活Fas/DAXX/ASK1/JNK通路诱导细胞凋亡。
2.探讨lncRNA3901对SUMO1/DAXX信号通路的调控作用，进一步阐明lncRNA3901调控缺氧复氧诱导内皮细胞凋亡的分子机制。
【方法】
实验用人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)建立缺氧复氧模型，模拟体内缺血再灌注损伤，将正常培养的HUVEC培养至80%的密度时，换用无糖和无血清的培养基后放置于密封的缺氧小室(Chamber)中，充入低氧三元气体(94%N2、5%CO2、1%O2)，并将缺氧小室放入37℃恒温箱培养12h，然后将培养基换为完全培养基，继续正常培养8h。(1)首先验证HR诱导内皮细胞凋亡，并激活Fas/DAXX相关信号通路。流式细胞术检测细胞凋亡率；免疫荧光实验和WesternBlot检测DAXX核质分布水平；WesternBlot检测DAXX、Fas通路以及凋亡相关蛋白的表达水平。(2)RT-PCR验证HR模型中lncRNA3901的表达水平；敲低、过表达lncRNA3901，检测lncRNA3901差异表达对DAXX胞内分布的调控，以及对HR诱导细胞凋亡的影响。(3)利用FISH实验分析lncRNA3901亚细胞定位；通过RNAPull-down实验、生物质谱和RNA免疫沉淀(RIP)技术筛选并验证lncRNA3901与SUMO1蛋白相结合。(4)利用CO-IP实验验证HR诱导DAXX蛋白SUMO化水平的变化；敲低SUMO1，观察DAXX蛋白SUMO化水平改变与DAXX核质分布改变的关系，以及敲低SUMO1对HR诱导细胞凋亡的影响。(5)敲低、过表达lncRNA3901，利用CO-IP检测lncRNA3901表达差异对DAXXSUMO化水平的影响；将SUMO1表达质粒共转染至lncRNA3901过表达细胞系，观察SUMO1表达上调对lncRNA3901过表达诱导的细胞凋亡的影响。
【结果】
1．HR激活DAXX/ASK1通路诱导内皮细胞凋亡。流式结果显示，HR可以诱导内皮细胞调亡，使用JNK抑制剂SP600125预处理能减少HR诱导的细胞凋亡；免疫荧光实验和核质分离WesternBlot结果显示，NC组细胞中DAXX主要在细胞核内分布，HR处理能显著诱导DAXX转移至细胞质中。WesternBlot结果显示，HR组细胞的BAX、cleaved-caspase3等凋亡相关蛋白表达增加，同时HR组Fas、p-ASK1、p-JNK等Fas通路蛋白水平明显上调。
2．lncRNA3901在HR处理的内皮细胞中表达上调。敲低lncRNA3901可抑制DAXX细胞质分布、抑制Fas通路激活，同时减少HR诱导的细胞凋亡；过表达lncRNA3901能促进HR诱导的DAXX细胞质分布和内皮细胞凋亡。
3．FISH实验表明lncRNA3901在细胞质中丰富表达，RNAPull-down实验联合蛋白质谱分析筛选，以及RIP实验反向证实lncRNA3901与SUMO1蛋白相结合。进一步行deletedmapping实验发现，lncRNA3901的5’端1-250碱基序列是与SUMO1特异性结合的必须片段。
4．SUMO1调节DAXXSUMO化修饰水平：在HR诱导内皮细胞凋亡模型中，SUMO1结合蛋白的表达水平显著降低；同时CO-IP实验证实HR可以抑制DAXXSUMO化修饰。敲低SUMO1能增加HR诱导的DAXX细胞质转移，从而促进HR诱导细胞凋亡。
5．lncRNA3901调控DAXX的SUMO化水平：根据CO-IP和WesternBlot结果，敲低lncRNA3901时，HR对DAXXSUMO化抑制作用减少，细胞质中DAXX表达水平下降；过表达lncRNA则进一步增加HR对DAXXSUMO化抑制作用，细胞质中DAXX表达增多。而在细胞功能回复实验中，共转染过表达SUMO1可逆转过表达lncRNA3901后HR诱导的内皮细胞凋亡。
【结论】
lncRNA3901通过结合SUMO1，抑制SUMO1介导的DAXX蛋白SUMO化修饰，从而促进DAXX细胞质转移，进而促进HR诱导的内皮细胞凋亡。