论文部分内容阅读
癫痫是一种由多种病因引起的慢性综合症，严重危害患者健康，给个人、家庭及社会带来沉重负担，并在某些情况可能危及他人安全，比如在驾驶途中癫痫发作。大多数患者经长期的抗癫痫药物治疗可获得良好控制，部分患者可以停药，但约有30%癫痫患者虽经正规的、至少两种足量的抗癫痫药物治疗，仍无法有效控制癫痫发作，这部分癫痫被称为药物难治性癫痫。癫痫的频繁发作或癫痫持续状态，可导致患者的认知能力下降。对于正处在神经功能发育阶段的儿童癫痫患者，这种危害尤其严重。国外大宗癫痫手术病例的术后病理结果统计显示，大脑皮质发育障碍（malformation of cortical development,MCD）是三大主要病因之一，而MCD最主要的亚型局灶性皮质发育不良（focal cortical dysplasia,FCD）占儿童药物难治性癫痫患者病因的首位。
FCD以脑皮质局灶性发育不良为特征。2011年国际抗癫痫联盟（international league against epilepsy,ILAE）发布FCD的分类标准，将FCD分为3型，其中，FCDⅠ型与FCDⅡ型为孤立的FCD。FCDⅠ型主要表现为新皮质的正常6层细胞构筑变为放射状（Ⅰa）或切线状（Ⅰb）排列的异常分层，FCDⅡ型则以异形神经元（dysplastic neurons,DNs）出现，伴（Ⅱb）或不伴（Ⅱa）气球样细胞（balloon cells,BCs）为主要特征。临床中最常见的是FCDⅠa、Ⅱa、Ⅱb这3个亚型。
关于癫痫发作，普遍接受的病理生理机制是脑内兴奋/抑制失衡。在大脑，负责兴奋性递质释放的是谷氨酸能的主细胞（principal cells,PCs），即锥体神经元，而负责抑制性递质释放的是γ-氨基丁酸（aminobutyric acid,GABA）能的中间神经元（interneurons,INs）。在INs中，表达小清蛋白（parvalbumin,PV）的INs是其中数量最多、抑制效应最强的亚型；而生理效应最特殊的可能是表达血管活性肠肽（vasointestinal peptide,Vip）的INs，它的轴突不是优先投射于PCs，而是主要靶向投射于表达生长抑素（somatostatin,Sst）的INs，通过抑制Sst INs，间接促进PCs的兴奋效应。我们初期的预实验发现人FCD脑区Vip INs数目略有上升。据此，我们提出假设，即在FCD病灶的癫痫发生过程中可能存在如下机制：Vip INs活化，抑制了Sst INs的活性，使Sst INs对锥体细胞的抑制作用减弱，最终导致锥体神经元兴奋性活动失抑制而表现为癫痫发作。
之前有多篇文献报道，在FCD病灶中PV INs数量下降，但相关于其它INs亚型的研究资料却极少。在本研究的临床标本分析中，我们运用免疫组织化学技术（immunohistochemistry,IHC），回顾性地对我科标本库FCDⅠa、Ⅱa、Ⅱb三个亚型中PV、Sst、Vip阳性神经元进行定量分析，并设定PV、Sst、Vip阳性神经元总和为主要INs（major INs,mINs），对每种INs亚型与mINs的相对值进行比较；在动物实验部分，我们结合光遗传和膜片钳技术，对小鼠离体脑片中Vip对PCs的效应进行检测。最后，我们对与细胞去极化效应密切相关的TRPC3在FCD中的表达进行检测。得到的主要结果如下：
一、基于临床资料及病理标本的结果
1.对FCD患者临床资料的总结分析发现：（1）与FCDⅠa组相比，FCDⅡb组患者仅行单脑叶切除的患者比例更高；（2）与FCDⅠa组相比，FCDⅡ组中男性患者比例更高，枕叶受累更少。
2.对FCD病理标本中INs亚型定量分析发现：（1）与对照组相比，FCDⅡb组的Vip/mINs明显升高；（2）与对照组相比，FCDⅡb组中PV INs密度明显下降，在FCD Ia及FCDⅡb组的皮质浅部，PV/mINs明显下降；（3）与FCDⅠa组相比，FCDⅡb组中PV、Sst、Vip阳性细胞密度均下降。
3.TRPC3蛋白水平在FCD病灶中表达上调。IHC结果提示TRPC3在FCD Ia的微柱列及FCDⅡ的DNs与BCs中呈中到强表达。
二、动物实验的结果
1．小鼠x线照射制备大脑MCD模型，并进行评价，发现：（1）不同于E16.5天大鼠γ射线MCD模型的最适剂量为2.25Gy，小鼠E16.5天x射线MCD模型最适剂量为1.6Gy；（2）评价小鼠x射线MCD模型，发现该模型小鼠：癫痫发作阈值降低，脑皮质面积缩小，四叠体暴露，一些部位的皮质分层紊乱，部分小鼠海马CA1区锥体神经元线性排列中断，皮质及海马内形成神经元异位结节灶。
2.以Vip-Cre转基因小鼠结合光遗传、膜片钳等技术进行实验发现：（1）在微分干涉相差显微镜下可见MCD模型鼠皮质中神经元极性消失、排列紊乱；（2）膜片钳单细胞记录发现荧光标记细胞的动作电位在低强度电流注入时呈典型不规则发放模式，在高强度电流注入时呈规律发放；（3）470nm激光光源以40Hz的频率持续照射Vip INs，在单纯病毒注射组中，对锥体神经元记录显示其兴奋性变化不明显，而在MCD组中，锥体神经元兴奋性增高；而两组中Vip INs兴奋性均增高。
综上所述，本研究结论如下：
1.临床资料显示FCDⅠa患者癫痫发作较FCDⅡb组更严重。
2.从不同INs亚型发生时间不同的角度分析，FCDⅡb患者病理机制发生时间早于FCD Ia。
1.FCDⅠa及FCDⅡb组的皮质浅部PV/mINs明显下降提示PV INs数量的相对变化可能参与了FCDⅠa与Ⅱb中癫痫的发生；而FCDⅡb组的Vip/mINs明显升高提示Vip INs的数量变化可能参与了FCDⅡb中癫痫的发生。
2.不同于大鼠γ射线MCD模型2.25Gy的最适剂量，小鼠x射线MCD模型最适剂量为1.6Gy；对该模型的评价证明这是一个较理想的小鼠MCD模型。
3.膜片钳实验结果显示在MCD小鼠模型中，Vip INs对锥体神经元的失抑制效应强于正常对照组。
4.TRPC3表达上调可能强化了FCD病灶中兴奋性神经元的去极化效应。
综合以上结论，我们认为MCD中Vip INs的失抑制效应的增强提高了患者的癫痫易感性，另外，TRPC3表达上调可能也参与了MCD癫痫的发生。
FCD以脑皮质局灶性发育不良为特征。2011年国际抗癫痫联盟（international league against epilepsy,ILAE）发布FCD的分类标准，将FCD分为3型，其中，FCDⅠ型与FCDⅡ型为孤立的FCD。FCDⅠ型主要表现为新皮质的正常6层细胞构筑变为放射状（Ⅰa）或切线状（Ⅰb）排列的异常分层，FCDⅡ型则以异形神经元（dysplastic neurons,DNs）出现，伴（Ⅱb）或不伴（Ⅱa）气球样细胞（balloon cells,BCs）为主要特征。临床中最常见的是FCDⅠa、Ⅱa、Ⅱb这3个亚型。
关于癫痫发作，普遍接受的病理生理机制是脑内兴奋/抑制失衡。在大脑，负责兴奋性递质释放的是谷氨酸能的主细胞（principal cells,PCs），即锥体神经元，而负责抑制性递质释放的是γ-氨基丁酸（aminobutyric acid,GABA）能的中间神经元（interneurons,INs）。在INs中，表达小清蛋白（parvalbumin,PV）的INs是其中数量最多、抑制效应最强的亚型；而生理效应最特殊的可能是表达血管活性肠肽（vasointestinal peptide,Vip）的INs，它的轴突不是优先投射于PCs，而是主要靶向投射于表达生长抑素（somatostatin,Sst）的INs，通过抑制Sst INs，间接促进PCs的兴奋效应。我们初期的预实验发现人FCD脑区Vip INs数目略有上升。据此，我们提出假设，即在FCD病灶的癫痫发生过程中可能存在如下机制：Vip INs活化，抑制了Sst INs的活性，使Sst INs对锥体细胞的抑制作用减弱，最终导致锥体神经元兴奋性活动失抑制而表现为癫痫发作。
之前有多篇文献报道，在FCD病灶中PV INs数量下降，但相关于其它INs亚型的研究资料却极少。在本研究的临床标本分析中，我们运用免疫组织化学技术（immunohistochemistry,IHC），回顾性地对我科标本库FCDⅠa、Ⅱa、Ⅱb三个亚型中PV、Sst、Vip阳性神经元进行定量分析，并设定PV、Sst、Vip阳性神经元总和为主要INs（major INs,mINs），对每种INs亚型与mINs的相对值进行比较；在动物实验部分，我们结合光遗传和膜片钳技术，对小鼠离体脑片中Vip对PCs的效应进行检测。最后，我们对与细胞去极化效应密切相关的TRPC3在FCD中的表达进行检测。得到的主要结果如下：
一、基于临床资料及病理标本的结果
1.对FCD患者临床资料的总结分析发现：（1）与FCDⅠa组相比，FCDⅡb组患者仅行单脑叶切除的患者比例更高；（2）与FCDⅠa组相比，FCDⅡ组中男性患者比例更高，枕叶受累更少。
2.对FCD病理标本中INs亚型定量分析发现：（1）与对照组相比，FCDⅡb组的Vip/mINs明显升高；（2）与对照组相比，FCDⅡb组中PV INs密度明显下降，在FCD Ia及FCDⅡb组的皮质浅部，PV/mINs明显下降；（3）与FCDⅠa组相比，FCDⅡb组中PV、Sst、Vip阳性细胞密度均下降。
3.TRPC3蛋白水平在FCD病灶中表达上调。IHC结果提示TRPC3在FCD Ia的微柱列及FCDⅡ的DNs与BCs中呈中到强表达。
二、动物实验的结果
1．小鼠x线照射制备大脑MCD模型，并进行评价，发现：（1）不同于E16.5天大鼠γ射线MCD模型的最适剂量为2.25Gy，小鼠E16.5天x射线MCD模型最适剂量为1.6Gy；（2）评价小鼠x射线MCD模型，发现该模型小鼠：癫痫发作阈值降低，脑皮质面积缩小，四叠体暴露，一些部位的皮质分层紊乱，部分小鼠海马CA1区锥体神经元线性排列中断，皮质及海马内形成神经元异位结节灶。
2.以Vip-Cre转基因小鼠结合光遗传、膜片钳等技术进行实验发现：（1）在微分干涉相差显微镜下可见MCD模型鼠皮质中神经元极性消失、排列紊乱；（2）膜片钳单细胞记录发现荧光标记细胞的动作电位在低强度电流注入时呈典型不规则发放模式，在高强度电流注入时呈规律发放；（3）470nm激光光源以40Hz的频率持续照射Vip INs，在单纯病毒注射组中，对锥体神经元记录显示其兴奋性变化不明显，而在MCD组中，锥体神经元兴奋性增高；而两组中Vip INs兴奋性均增高。
综上所述，本研究结论如下：
1.临床资料显示FCDⅠa患者癫痫发作较FCDⅡb组更严重。
2.从不同INs亚型发生时间不同的角度分析，FCDⅡb患者病理机制发生时间早于FCD Ia。
1.FCDⅠa及FCDⅡb组的皮质浅部PV/mINs明显下降提示PV INs数量的相对变化可能参与了FCDⅠa与Ⅱb中癫痫的发生；而FCDⅡb组的Vip/mINs明显升高提示Vip INs的数量变化可能参与了FCDⅡb中癫痫的发生。
2.不同于大鼠γ射线MCD模型2.25Gy的最适剂量，小鼠x射线MCD模型最适剂量为1.6Gy；对该模型的评价证明这是一个较理想的小鼠MCD模型。
3.膜片钳实验结果显示在MCD小鼠模型中，Vip INs对锥体神经元的失抑制效应强于正常对照组。
4.TRPC3表达上调可能强化了FCD病灶中兴奋性神经元的去极化效应。
综合以上结论，我们认为MCD中Vip INs的失抑制效应的增强提高了患者的癫痫易感性，另外，TRPC3表达上调可能也参与了MCD癫痫的发生。