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研究背景：
关节透明软骨是由透明软骨细胞和细胞外基质组成的一种特殊形式的结缔组织，覆盖在滑膜关节的表面，可吸收震荡，减少关节面之间的摩擦，分泌滑液，对关节起润滑和营养的作用，是滑液关节发挥生理功能不可或缺的部分。然而，由于本身无神经支配，无血管及淋巴循环的固有特点，关节透明软骨的营养来源有限，而且透明软骨细胞长期处于低有丝分裂活性并被包裹在致密的细胞外基质中，迁移能力差，其再生潜能微弱，一旦损伤，常导致严重后果。
目前临床常用的关节软骨损伤治疗方法有：关节镜下关节腔清理术、微骨折术、自体骨与软骨移植镶嵌术、自体软骨细胞移植术和基质诱导的自体软骨细胞移植术等，但这些治疗方法往往最终形成纤维样软骨，无法达到正常关节软骨的生理功能，而且极易发生退变，引发退行性关节疾病，出现关节持续疼痛甚至导致关节功能丧失，大大降低了治疗效果。
近年来，随着软骨组织工程技术的日益成熟，使透明软骨的完全再生修复成为可能。软骨组织工程的首要素为种子细胞，寻求理想的种子细胞是该技术成功的关键。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)拥有快速自我更新及增殖能力，多向分化潜能突出，是软骨组织工程最为重要的种子细胞来源。
MSCs可以从骨髓、骨骼肌、滑膜、脂肪、脐带华通氏胶等多种组织中分离提取。最近的研究证实，关节液(synovial fluid，SF)中也发现了MSCs的存在，通过相应技术手段可以实现MSCs的分离提取。关节液来源的MSCs(synovial fluid derived mesenchymal stem cells，SF-MSCs)拥有极强的体外成透明软骨细胞分化潜能，而且来源广泛，易分离提取及培养，更符合软骨组织工程对于优质种子细胞的要求。
目前，针对SF-MSCs的分离提取方法存在分离效率低下，耗时且花费大等缺点，至今尚无稳定高效的SF-MSCs分离提取方法。体外定向诱导SF-MSCs成透明软骨细胞分化是构建组织工程化透明软骨的关键。但目前尚无体外定向诱导SF-MSCs成软骨细胞分化的稳定培养体系。另外，MSCs体外成软骨细胞分化的过程中极易出现细胞肥大化的现象，极大降低了新生软骨细胞的质量，如何有效避免新生软骨细胞肥大化、维持软骨细胞稳定表型和正常生理功能是目前研究的难点。对于种子细胞的基础研究，最终目的是用于关节透明软骨再生，达到完全治愈关节软骨损伤的效果，但目前对于SF-MSCs的研究大都停留在体外基础实验方面，针对SF-MSCs的体内实验研究甚少，尚无hSF-MSCs的临床应用相关报道。
最近的研究发现，新型小分子有机化合物Kartogenin(KGN)能诱导骨髓来源间充质干细胞(bone marrow-MSCs，BM-MSCs)分化为软骨细胞，同时具有保护软骨细胞，修复受损关节软骨的功能。但是，随后的实验研究大都围绕KGN对BM-MSCs的作用来开展，目前尚无KGN应用于SF-MSCs的研究报道。另外，KGN保护软骨细胞是否与抑制软骨细胞肥大化有关，具体机制仍有待阐明。
为体外构建组织工程化透明软骨并最终实现体内关节透明软骨的完全再生，本实验以hSF-MSCs为研究重点，从hSF-MSCs的分离提取及培养开始，探索一种简单高效的SF-MSCs分离培养及纯化方案；通过体外实验，建立一套体外定向诱导SF-MSCs成透明软骨细胞分化的稳定培养体系；对KGN是否抑制由hSF-MSCs分化而来的软骨细胞肥大化，及其分子机制进行研究；开展动物实验，研究SF-MSCs体内再生透明软骨以及修复关节软骨损伤的效果，为SF-MSCs的临床转化研究提供动物实验基础。
方法：
第一部分：采用贴壁培养法获取贴壁细胞，挑选单克隆细胞集落初步纯化细胞；扩增培养后采用CD90免疫磁珠分选法(magnetic activated cell sorting，MACS)进一步纯化hSF-MSCs；流式细胞仪鉴定细胞表面标记物，三向分化诱导实验检测其多向分化潜能，采用单细胞RNA测序技术，检测hSF-MSCs的异质性。
第二部分：高密度hSF-MSCs在体外二维(单层)及三维(Pellet)培养条件下，通过联合应用TGF-β3、KGN以及单独应用TGF-β3、KGN诱导hSF-MSCs定向成透明软骨细胞分化。体外诱导3周后，通过RT-qPCR、免疫荧光染色、Western-blot、组织学染色等手段检测正常软骨细胞特异性基因和蛋白的表达水平，并检测软骨细胞肥大化特异性基因和蛋白的变化情况。
第三部分：构建CBFβ、SMAD5、Runx2病毒载体并转染hSF-MSCs，使其在细胞内过表达，TGF-β3/KGN处理细胞48h，通过原位核基质分离提取技术和间接免疫荧光染色技术，观察CBFβ、SMAD5、Runx1、Runx2在细胞质中的分布以及在细胞核基质中的定位情况。分析TGF-β3/KGN对相关信号通路及核转录因子核基质定位的影响并绘制调控通路示意图。
第四部分：分离提取并纯化兔膝关节液SF-MSCs(rbSF-MSCs)，兔膝关节股骨滑车非负重区全层软骨缺损造模，将体外预成软骨细胞分化和未诱导的自体rbSF-MSCs通过关节腔注射的方式，移植入兔膝关节腔用来治疗关节软骨损伤。在关节腔注射rbSF-MSCs治疗后的第8周、12周处死各组实验动物，收集股骨髁标本，对关节软骨缺损的修复情况进行大体观察及评分、免疫组织化学染色及评分，RT-qPCR检测新生组织透明软骨特异性基因的表达情况，来评估SF-MSCs的体内再生透明软骨及修复关节软骨损伤的效果。
结果：
筛选贴壁培养形成的单克隆细胞集落，并通过CD90免疫磁珠分选法成功分离培养及纯化hSF-MSCs；经流式细胞术鉴定，hSF-MSCs符合MSCs表面抗原标记物鉴定标准；三系分化实验成功诱导hSF-MSCs分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞；单细胞测序发现，hSF-MSCs存在一定的异质性，经分析发现有7个细胞亚群，各亚群有不同的功能。TGF-β3和KGN的联合应用相比单独应用，能更好地促进hSF-MSCs分化为透明软骨细胞，两者发挥正协同效应；TGF-β3诱发软骨细胞出现肥大化，而KGN可抑制此现象；KGN作用于hSF-MSCs，可促进CBFβ入核，与Runx1在核基质中共定位，形成CBFβ-Runx1复合体，激活Runx1的转录活性，同时，该复合体竞争性抑制Runx2细胞核基质定位；KGN抑制SMAD5入核，进而抑制了Runx2核基质靶向信号的激活，使Runx2不能准确核基质定位并启动转录活性，其对下游软骨细胞肥大化相关基因的调控作用被抑制；首次成功分离提取出兔膝关节rbSF-MSCs，经鉴定，高表达MSCs表面标记物并具有多向分化潜能；动物实验证实，经膝关节腔注射自体rbSF-MSCs可以有效治疗兔关节软骨损伤，促进透明软骨再生，为后续SF-MSCs临床转化研究提供了充足的动物研究基础。
关节透明软骨是由透明软骨细胞和细胞外基质组成的一种特殊形式的结缔组织，覆盖在滑膜关节的表面，可吸收震荡，减少关节面之间的摩擦，分泌滑液，对关节起润滑和营养的作用，是滑液关节发挥生理功能不可或缺的部分。然而，由于本身无神经支配，无血管及淋巴循环的固有特点，关节透明软骨的营养来源有限，而且透明软骨细胞长期处于低有丝分裂活性并被包裹在致密的细胞外基质中，迁移能力差，其再生潜能微弱，一旦损伤，常导致严重后果。
目前临床常用的关节软骨损伤治疗方法有：关节镜下关节腔清理术、微骨折术、自体骨与软骨移植镶嵌术、自体软骨细胞移植术和基质诱导的自体软骨细胞移植术等，但这些治疗方法往往最终形成纤维样软骨，无法达到正常关节软骨的生理功能，而且极易发生退变，引发退行性关节疾病，出现关节持续疼痛甚至导致关节功能丧失，大大降低了治疗效果。
近年来，随着软骨组织工程技术的日益成熟，使透明软骨的完全再生修复成为可能。软骨组织工程的首要素为种子细胞，寻求理想的种子细胞是该技术成功的关键。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)拥有快速自我更新及增殖能力，多向分化潜能突出，是软骨组织工程最为重要的种子细胞来源。
MSCs可以从骨髓、骨骼肌、滑膜、脂肪、脐带华通氏胶等多种组织中分离提取。最近的研究证实，关节液(synovial fluid，SF)中也发现了MSCs的存在，通过相应技术手段可以实现MSCs的分离提取。关节液来源的MSCs(synovial fluid derived mesenchymal stem cells，SF-MSCs)拥有极强的体外成透明软骨细胞分化潜能，而且来源广泛，易分离提取及培养，更符合软骨组织工程对于优质种子细胞的要求。
目前，针对SF-MSCs的分离提取方法存在分离效率低下，耗时且花费大等缺点，至今尚无稳定高效的SF-MSCs分离提取方法。体外定向诱导SF-MSCs成透明软骨细胞分化是构建组织工程化透明软骨的关键。但目前尚无体外定向诱导SF-MSCs成软骨细胞分化的稳定培养体系。另外，MSCs体外成软骨细胞分化的过程中极易出现细胞肥大化的现象，极大降低了新生软骨细胞的质量，如何有效避免新生软骨细胞肥大化、维持软骨细胞稳定表型和正常生理功能是目前研究的难点。对于种子细胞的基础研究，最终目的是用于关节透明软骨再生，达到完全治愈关节软骨损伤的效果，但目前对于SF-MSCs的研究大都停留在体外基础实验方面，针对SF-MSCs的体内实验研究甚少，尚无hSF-MSCs的临床应用相关报道。
最近的研究发现，新型小分子有机化合物Kartogenin(KGN)能诱导骨髓来源间充质干细胞(bone marrow-MSCs，BM-MSCs)分化为软骨细胞，同时具有保护软骨细胞，修复受损关节软骨的功能。但是，随后的实验研究大都围绕KGN对BM-MSCs的作用来开展，目前尚无KGN应用于SF-MSCs的研究报道。另外，KGN保护软骨细胞是否与抑制软骨细胞肥大化有关，具体机制仍有待阐明。
为体外构建组织工程化透明软骨并最终实现体内关节透明软骨的完全再生，本实验以hSF-MSCs为研究重点，从hSF-MSCs的分离提取及培养开始，探索一种简单高效的SF-MSCs分离培养及纯化方案；通过体外实验，建立一套体外定向诱导SF-MSCs成透明软骨细胞分化的稳定培养体系；对KGN是否抑制由hSF-MSCs分化而来的软骨细胞肥大化，及其分子机制进行研究；开展动物实验，研究SF-MSCs体内再生透明软骨以及修复关节软骨损伤的效果，为SF-MSCs的临床转化研究提供动物实验基础。
方法：
第一部分：采用贴壁培养法获取贴壁细胞，挑选单克隆细胞集落初步纯化细胞；扩增培养后采用CD90免疫磁珠分选法(magnetic activated cell sorting，MACS)进一步纯化hSF-MSCs；流式细胞仪鉴定细胞表面标记物，三向分化诱导实验检测其多向分化潜能，采用单细胞RNA测序技术，检测hSF-MSCs的异质性。
第二部分：高密度hSF-MSCs在体外二维(单层)及三维(Pellet)培养条件下，通过联合应用TGF-β3、KGN以及单独应用TGF-β3、KGN诱导hSF-MSCs定向成透明软骨细胞分化。体外诱导3周后，通过RT-qPCR、免疫荧光染色、Western-blot、组织学染色等手段检测正常软骨细胞特异性基因和蛋白的表达水平，并检测软骨细胞肥大化特异性基因和蛋白的变化情况。
第三部分：构建CBFβ、SMAD5、Runx2病毒载体并转染hSF-MSCs，使其在细胞内过表达，TGF-β3/KGN处理细胞48h，通过原位核基质分离提取技术和间接免疫荧光染色技术，观察CBFβ、SMAD5、Runx1、Runx2在细胞质中的分布以及在细胞核基质中的定位情况。分析TGF-β3/KGN对相关信号通路及核转录因子核基质定位的影响并绘制调控通路示意图。
第四部分：分离提取并纯化兔膝关节液SF-MSCs(rbSF-MSCs)，兔膝关节股骨滑车非负重区全层软骨缺损造模，将体外预成软骨细胞分化和未诱导的自体rbSF-MSCs通过关节腔注射的方式，移植入兔膝关节腔用来治疗关节软骨损伤。在关节腔注射rbSF-MSCs治疗后的第8周、12周处死各组实验动物，收集股骨髁标本，对关节软骨缺损的修复情况进行大体观察及评分、免疫组织化学染色及评分，RT-qPCR检测新生组织透明软骨特异性基因的表达情况，来评估SF-MSCs的体内再生透明软骨及修复关节软骨损伤的效果。
结果：
筛选贴壁培养形成的单克隆细胞集落，并通过CD90免疫磁珠分选法成功分离培养及纯化hSF-MSCs；经流式细胞术鉴定，hSF-MSCs符合MSCs表面抗原标记物鉴定标准；三系分化实验成功诱导hSF-MSCs分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞；单细胞测序发现，hSF-MSCs存在一定的异质性，经分析发现有7个细胞亚群，各亚群有不同的功能。TGF-β3和KGN的联合应用相比单独应用，能更好地促进hSF-MSCs分化为透明软骨细胞，两者发挥正协同效应；TGF-β3诱发软骨细胞出现肥大化，而KGN可抑制此现象；KGN作用于hSF-MSCs，可促进CBFβ入核，与Runx1在核基质中共定位，形成CBFβ-Runx1复合体，激活Runx1的转录活性，同时，该复合体竞争性抑制Runx2细胞核基质定位；KGN抑制SMAD5入核，进而抑制了Runx2核基质靶向信号的激活，使Runx2不能准确核基质定位并启动转录活性，其对下游软骨细胞肥大化相关基因的调控作用被抑制；首次成功分离提取出兔膝关节rbSF-MSCs，经鉴定，高表达MSCs表面标记物并具有多向分化潜能；动物实验证实，经膝关节腔注射自体rbSF-MSCs可以有效治疗兔关节软骨损伤，促进透明软骨再生，为后续SF-MSCs临床转化研究提供了充足的动物研究基础。