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研究背景与目的胆管细胞癌是来源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，其侵袭和转移能力强，手术根治率低，预后极差。目前全世界仍然缺乏早期发现及综合治疗胆管癌的理想办法和方案。从基因水平研究其侵袭转移的机制，为寻求基因治疗方法，对于提高胆管癌的疗效，有着重要意义。本课题组长期从事胆管癌的研究。经过对胆管癌相关基因Fascin的研究，我们发现Fascin在胆管癌组织中异常高表达，且与胆管癌的侵袭与转移相关。通过RAN干扰沉默技术和裸鼠成瘤实验，我们证实通过RNA干扰技术下调Fascin的表达能抑制胆管癌的生长并降低胆管癌的侵袭和增殖能力，并发现Fascin促进肿瘤侵袭转移可能是通过诱导胆管癌EMT发生所致，且Fascin诱导EMT的发生与Wnt/β-catenin信号通路有关。为了进一步探讨Fascin可能参与的信号通路及其下游调控基因。以RNA干扰沉默下调Fascin表达的胆管癌细胞为模型，通过Affymetrix表达谱芯片分析筛选差异表达基因。通过对差异表达基因进行Pathway分析和Gene Ontology分析，我们进一步筛查出MLF1IP可能为Fascin发挥功能的靶基因。本实验对MLF1IP基因进行进一步研究。人髓细胞白血病因子1相互作用蛋白基因（The myelodysplasia/myeloidleukemia factor1-interacting protein，MLF1IP）位于染色体的4q35.1,它编码的蛋白有多个经典的结构功能域。Hanissian等研究发现MLF1IP基因在神经胶质瘤中有异常高表达。又有研究表明MLF1IP促进了真性红细胞增多症的发生。目前，国内外暂无关于MLF1IP与胆管癌的相关研究报道。其在胆管癌的发生发展中的作用和机制尚不明确。基于我们前期的研究及MLF1IP独特的生物学功能，我们推断，MLF1IP可能在胆管癌的发生发展过程中起着重要作用，并有可能是Fascin发挥功能的靶基因。本实验运用实时荧光定量聚合酶链式反应技术（Real-timePCR）初步检测MLF1IP在胆管癌手术切除标本和癌旁组织中的表达，观察胆管癌组织中是否有MLF1IP的表达上调。同时应用慢病毒介导的RNA干扰技术沉默MLF1IP基因在胆管癌RBE细胞系中的表达，应用MTT方法检测RNA干扰沉默MLF1IP表达后增殖能力变化，初步探讨其在胆管癌中的作用。为进一步完善对MLF1IP基因的研究，明确其在胆管癌的发生发展中的作用奠定基础。方法1.收集湖南省人民医院2013年6月至12月间10例手术切除胆管细胞癌和癌旁组织标本，应用Real-timePCR方法检测所有标本中MLF1IP的表达。分析胆管癌组织和癌旁组织中MLF1IP表达的差异，初步探讨MLF1IP跟胆管癌的关系。2.设计针对MLF1IP基因的siRNA序列，构建重组shRNA质粒并进行慢病毒包装。将人胆管癌RBE细胞株分为实验组和对照组，分别转染MLF1IP-shRNA和shRNA慢病毒载体。采用荧光显微镜直接观察评价转染效果，Real-time PCR检测各组细胞内MLF1IP基因的mRNA表达差异，评估干扰效率。3.通过MTT法检测实验组和对照组胆管细胞系的增殖能力，以初步研究MLF1IP对胆管癌的生物学行为的影响。结果1.在10例胆管癌病人的癌组织跟癌旁组织标本中，胆管癌组MLF1IP基因的mRNA相对表达量为5.03±1.96，癌旁组MLF1IP基因的mRNA相对表达量为1.40±1.07。胆管癌组织中MLF1IP的表达明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P=0.000）。2.成功构建了MLF1IP-shRNA慢病毒质粒，DNA测序结果显示重组质粒DNA序列与预期吻合。将含有MLF1IP-shRNA的重组质粒及其两种辅助包装质粒转染293T细胞进行病毒包装，60h后可见GFP绿色荧光蛋白大量表达，且细胞生长良好，提示慢病毒包装成功。将病毒浓缩，用荧光法进行滴度测定，滴度结果显示为：3×108。将慢病毒分别感染RBE细胞，荧光显微镜观察感染效率达到80%以上。Real-time PCR检测两组细胞的MLF1IP基因表达情况，结果显示实验组MLF1IP基因的mRNA相对表达量为0.15±0.02，对照组MLF1IP基因的mRNA相对表达量为1.01±0.12。实验组MLF1IP的表达明显低于对照组，差异有统计学意义（P=0.005）。其基因敲减效率为85%。3. MTT法检测两组细胞的OD值，并绘制细胞生长曲线，结果提示实验组细胞的生长曲线走行平缓，比对照组细胞的生长速度明显降低，其中第三、四和第五天，实验组比对照组细胞的OD值显著降低（p<0.05）。以第五天的OD值计算，实验组相对于对照组其抑制倍数为13.30倍。提示靶向抑制RBE细胞MLF1IP基因表达后，胆管癌细胞的增殖活力明显受到抑制。结论1. MLF1IP在胆管癌组织中表达相对于癌旁组织明显高，提示MLF1IP有可能在胆管癌的发生发展中起到促进作用。2.成功的构建了MLF1IP-shRNA慢病毒载体，并进行慢病毒包装，有效转染了RBE细胞，下调了MLF1IP基因的表达，构建了稳定MLF1IP低表达的胆管癌细胞系。为进一步研究MLF1IP在胆管癌中的作用提供了工具细胞。3. RNA干扰沉默MLF1IP基因的表达使胆管癌细胞RBE增殖能力明显下降。