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肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的发生是一个多因素多阶段的复杂过程,迄今没有有效的根治办法。寻求新的治疗方法和治疗新靶标是目前肝细胞性肝癌治疗的迫切需求。目前国内外研究一直致力于通过阻断肿瘤新生血管形成来达到治疗肿瘤的目的。血管生成抑制剂,特别是多肽或内源性肽可能成为异常血管生成依赖性疾病最安全最低毒的治疗措施。内皮抑制素(endostatin)是胶原蛋白XVIII羧基末端水解而来的20 k Da多肽片段,是一种内源性血管形成抑制因子,特异性地抑制内皮细胞增生和迁移,对血管形成及肿瘤生长具有明显抑制作用。此外研究证实内皮抑素对乳腺癌、大肠癌等肿瘤细胞也具有直接的抑制作用。但正如许多血管生成抑制剂一样,内皮抑素单一给药并不能获得显著地疗效,加之蛋白制剂存在的问题从而使美国于2003年终止对内皮抑素的临床开发。近年来靶向制剂的研究俨然已经成为国内外药剂研究的热点之一。CSP I-plus是从疟原虫环子孢子蛋白(Circumsprozoite protein,CSP)中筛选得到的能够特异识别并黏附在肝细胞表面的多肽序列。利用CSP I-plus的这一特性,本实验室采用基因工程技术和原核表达系统成功制备新型肝靶向人内皮抑素r ES-CSP。目前,该融合蛋白对内皮细胞的抑制作用以及肝靶向性已经得到证实,但对肝癌细胞的作用尚无研究报道,有待进一步探讨。本论文意在进一步从体内原位肝癌模型验证rES-CSP肝靶向性的基础上,采用Hep G2细胞和裸鼠原位肝癌模型从细胞和动物整体水平评价其抗肝癌效果并初步探讨凋亡相关的分子机制。研究目的本论文通过研究新型肝靶向人内皮抑素r ES-CSP对肝癌细胞的直接抑制作用,为r ES-CSP抑制肝癌生长的作用靶点进行了补充,从而为肝癌靶向治疗提供新的科学依据和药物开发思路。研究方法1.探讨r ES-CSP的肝靶向性1.1 r ES-CSP的裸鼠体内分布实验:建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,通过瘤块种植法法建立肝原位移植瘤模型。将裸鼠随机分为空白对照(生理盐水)组,重组人血管内皮抑素(r Endostatin)组,融合蛋白(r ES-CSP)组。建模1月后单次尾静脉给药,分别于5、30和60 min取血后处死动物,取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织制备匀浆,ELISA方法测定各样品中内皮抑素浓度。2.探讨r ES-CSP的体外抗HCC作用及凋亡相关分子机制2.1 MTS方法分别检测给予终浓度为12μM、6μM、1.2μM、0.6μM、0.06μM的重组人血管内皮抑制素、CSP I-plus和肝靶向人内皮抑素r ES-CSP作用24 h和48 h后对Hep G2、Chang’s和A549细胞的毒性作用,以选择合适的药物浓度进行后续的活性研究。其后,分别从迁移分析、流式细胞术和透射电镜来考察r ES-CSP抗肝癌细胞迁移及对细胞周期和凋亡的影响。2.2 Western Blot检测r ES-CSP诱导肝癌细胞凋亡的相关分子机制,分别给予终浓度为0.6μM、6μM的重组人内皮抑制素和肝靶向人内皮抑素r ES-CSP作用24 h后收集细胞并裂解,提取蛋白后分别与凋亡蛋白Caspase 8抗体、凋亡抑制蛋白Bcl-2抗体进行免疫印迹实验,检测并分析细胞内Caspase 8和Bcl-2的表达变化。3.探讨r ES-CSP的体内抗HCC作用3.1建立肝原位移植瘤模型,实验动物随机分为3组,每组10只:①空白组(生理盐水),②r Endostatin(6μM)组,③r ES-CSP(6μM)组。建模1周后隔天静脉给药,连续用药30天。处死动物,观察肝脏肿瘤生长情况,剥离肝组织中的瘤块称瘤重,计算抑瘤率;3.2取肝癌组织做石蜡切片,HE染色观察组织的病理学改变。免疫组化比较肝癌组织中CD31的表达变化。4.数据统计与分析:实验数据均以均数与标准差(sx±)表示,应用SPSS 13.0统计软件分析处理实验数据。采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐时多重比较采用LSD法;方差不齐时,多重比较采用Dunnett T 3法。P﹤0.05为差异有统计学意义。实验结果1.探讨r ES-CSP的肝靶向性:1.1肝原位种植瘤模型制备:取人肝癌细胞系Hep G2制备皮下移植瘤,后将肿瘤组织接种于裸鼠肝内,建立裸鼠肝原位移植瘤模型。1.2 r ES-CSP的裸鼠体内分布实验:荷肝癌原位裸鼠尾静脉给药,ELISA方法测定给药后5、30和60 min时裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肿瘤组织和血液中内皮抑素浓度,结果显示肝靶向内皮抑素与普通重组人内皮抑素组相比,各脏器内皮抑素浓度均有显著性差异(P﹤0.05);各时间点肝靶向人内皮抑素r ES-CSP组肝脏及肝癌组织内皮抑素浓度均高于普通内皮抑素组(P﹤0.01)。2.探讨r ES-CSP的体外抗HCC作用及凋亡相关分子机制2.1细胞毒性实验:MTS结果显示r ES-CSP对Hep G2细胞的增殖有抑制作用,且呈时间和剂量的依赖性。而CSP I-plus、r Endostatin均对肝癌细胞的增殖几乎无影响。同时在低浓度时,r ES-CSP对肝癌细胞的抑制作用明显高于Chang’s和A549细胞(P﹤0.01)。在6μM时,Hep G2细胞的存活率为46.3±2.31%,Chang’s和A549细胞的存活率分别为92.8±2.11%、93.2±2.96%。2.2细胞迁移实验:随着时间的推移,r ES-CSP组能显著抑制肝癌细胞划痕的愈合,与重组人内皮抑素组相比,差异具有统计学意义(P﹤0.05)。同时Transwell小室实验显示,与空白对照组相比,经6μM r Endostatin或r ES-CSP处理后的肝癌细胞迁移到下室的数量明显减少(P值均﹤0.05),迁移抑制率分别为27±1.75%、65.5±2.95%。2.3流式细胞术检测细胞周期和凋亡:结果显示,6μM r Endostatin作用24 h和48 h后,肝癌细胞的周期分布和凋亡几乎不受影响(P>0.05)。而r ES-CSP显著诱导肝癌细胞G2/M期细胞数目增加同时伴随着G0/G1和S期细胞减少(P﹤0.01),同时肝癌细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率显著高于对照组细胞(P﹤0.01)。2.4透射电镜观察细胞的凋亡:结果显示r ES-CSP处理后,肝癌细胞多出现中晚期凋亡,可见细胞膜出芽,凋亡小体形成,内含有退变的细胞器。核碎裂,核固缩,胞核染色质边集、成碎块状,核膜消失。2.5 Western blot检测凋亡相关蛋白的表达变化:r ES-CSP可显著降低Bcl-2蛋白表达水平,同时可能上调Caspase 8蛋白的表达。r Endostatin处理组对Bcl-2和Caspase8两种蛋白的表达影响不明显。3.探讨r ES-CSP的体内抗HCC作用及相关分子表达变化3.1体内对裸鼠肝癌原位移植瘤的抑制作用:r ES-CSP组与重组人血管内皮抑素组、对照组相比,瘤重和瘤体积均有显著性差异(P<0.05),结果表明r ES-CSP能显著抑制人肝癌裸鼠原位移植瘤的生长,重组人内皮抑素对肝癌的生长抑制作用不明显;r ES-CSP和r Endostatin组的人肝癌裸鼠荷瘤的抑瘤率为29.6±4.39%和5.30±1.23%。3.2 HE染色观察组织的病理变化:肝癌细胞呈浸润性生长,r ES-CSP组同实验对照组相比,r ES-CSP组癌组织多发生坏死,间质血管少于对照组,癌细胞核分裂相对减少,可见有大量白细胞和淋巴细胞浸润,表明r ES-CSP组对癌细胞生长有一定的抑制作用。然而部分肺病理切片观察可见肺泡间隔增厚,肺泡壁和细支气管壁有较多炎性细胞浸润,显示出较重的间质性肺炎病变。3.3免疫组织化学检测肝癌组织中微血管密度和凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达变化:与对照组相比,r Endostatin组和r ES-CSP组肿瘤组织微血管密度相对减小,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论肝靶向肽CSP I-plus修饰的重组人内皮抑素能靶向结合于肝细胞表面分子HSPG,从而在肝脏组织得到明显富集。体外抗HCC活性实验证实r ES-CSP可显著抑制肝癌细胞的增殖和迁移,阻滞细胞的复制周期,并且增加肝癌细胞的凋亡率。动物实验证实,r ES-CSP能够显著抑制裸鼠原位肝癌的生长,作用效果显著强于重组人血管内皮抑制素,并且肝癌组织CD31蛋白表达下调与重组人血管内皮抑制素组相比具有显著差异。综上所述,肝靶向肽CSP I-plus修饰的重组人内皮抑素能在肝脏组织富集,从而提高内皮抑素对肝癌细胞的靶向抑制作用,为肝癌的靶向治疗提供新的科学依据与药物开发依据。