鳜鱼(Siniperca chuaisi)俗称桂鱼、桂花鱼,是中国四大名贵淡水鱼之一,也是东亚地区重要的淡水经济鱼种。其肉质鲜美,少刺无腥,营养价值丰富,从古至今深受人们喜爱。由于鱼类是常见的过敏原之一,过敏者常会出现瘙痒、红疹等现象,这妨碍了过敏体质者对鳜鱼以及其他鱼类中优质蛋白的摄取。本研究探究微波场内美拉德反应对鳜鱼小清蛋白结构和免疫学特性的影响,主要利用微波加热模拟烹饪鱼的过程,用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖三种不同浓度的糖溶液分别与鳜鱼肉混合,在微波加热条件下进行美拉德反应,随后提取小清蛋白,通过液相色谱-串联质谱、免疫学和体外消化等手段研究处理后鱼肉中小清蛋白的变化。直接使用鱼肉进行美拉德反应可以更好地模拟家庭烹饪和食品加工工业中的生产过程,了解整个美拉德反应中小清蛋白的性质变化,这为后续鱼类加工产品中引入微波处理工艺达到降低免疫原性的研究提供基础数据。主要研究结果如下:(1)正交实验法研究不同因素对美拉德反应的影响:分别考察了糖种类、糖浓度、微波加热时间对褐变程度的影响,得到了最优的影响条件为:反应糖为葡萄糖、微波加热时间15 min,在本实验浓度水平范围内,糖浓度对褐变程度影响不显著(p>0.05)。参照正交实验组设计了电炉加热对照组和未处理样品组(Native),采用420 nm吸光度分析和丙烯酰胺凝胶电泳分析所有实验组美拉德反应程度,确定样品G3(葡萄糖,1.5 mol/L,15 min)和M2(麦芽糖,1mol/L,15 min)美拉德反应程度较高,并且电泳图显示美拉德反应后样品G3和M2小清蛋白分子质量最大。(2)美拉德反应后小清蛋白修饰位点和修饰基团分析:首先通过液相色谱串联质谱法测定未处理的鳜鱼小清蛋白氨基酸序列,通过质谱解析和Uniprot数据库的搜索,得出鳜鱼中小清蛋白的两个亚型Ⅰ、Ⅱ的全部氨基酸序列。对美拉德反应程度较高的两组对应的小清蛋白进行修饰位点分析,建立了手动分析样品G3、M2中小清蛋白修饰位点的方法。通过Analyst TF 1.7.1 software和Peak View 2.2等软件,在G3(葡萄糖,1.5 mol/L,15 min)和M2(麦芽糖,1mol/L,15 min)的小清蛋白中发现的修饰基团有甲酰基(Frm)、羧甲基(Cmc)、葡萄糖(G)和精氨酸(Arg),此外在M2中还发现一种美拉德反应中不常出现的修饰基团*(?M=97.03),初步推测*是一个硫酸根基团。LC-MS/MS结果表明,经美拉德反应后鳜鱼小清蛋白存在十一个不同的糖化修饰位点和五种修饰基团,这在某种程度上改变了小清蛋白保守区域结构的状态,阻断预测表位与IgE的结合,从而影响小清蛋白致敏性。(3)微波加热条件对鳜鱼小清蛋白抗原性和消化性的影响:从鳜鱼中分离纯化了小清蛋白,在新西兰大白兔体内获得多克隆抗体,测定了血清中抗体效价达到32000以上,符合其他文献报道的抗体效价要求。通过间接竞争性ELISA分析微波加热组和电炉加热对照组,以及未处理组(Native)中小清蛋白抗原性的变化差异,结果表明美拉德反应可以降低小清蛋白的抗原性。其中微波加热比电炉加热更有利于降低小清蛋白抗原性,在微波场内葡萄糖-美拉德反应体系中,获得的小清蛋白抗原性最低,和未处理小清蛋白相比,此体系样品G3(葡萄糖,1.5 mol/L,15 min)抗原性下降了66.03%。采用体外模拟胃消化实验评估微波加热样品(G3、M2、S1)、电炉加热样品(GHeating、M-Heating、S-Heating)以及未处理组(Native)的消化抗性,结果表明,与电炉加热相比,微波加热条件下的美拉德反应可以更好降低鳜鱼小清蛋白的抗原性,从而降低小清蛋白的免疫原性。在体外胃消化实验中,结果表明微波加热条件下的美拉德反应可以增加鳜鱼小清蛋白的消化性。