目的:角膜缘干细胞缺损是一组由多种疾病引起的,并导致多种严重角膜及眼表变化的眼科病变,是眼科急需解决的疑难问题,也是眼科研究的难点和重点之一。目前治疗严重角膜干细胞缺损的唯一可能有效的方法是角膜干细胞移植。由于国内角膜缘干细胞无大量的供体来源,细胞数量十分有限,不能满足众多患者移植手术的需要,更由于对双眼角膜干细胞缺损的病人,根本无角膜缘干细胞可取,因此如何利用有限的供体来源经体外培养扩增,获得大量的角膜缘干细胞,成为治疗双眼严重角膜干细胞缺损这一不治性致盲疾病的首要关键问题。目前,角膜缘干细胞培养的方法大多采用组织块培养法,但由于组织块法存在不能充分利用干细胞和无法形成连续的细胞层等弊端,我们采用悬浮细胞培养法对角膜缘细胞进行体外培养,以期获取大量的角膜缘干细胞。并通过检测细胞桥粒数及MTT法检测传代细胞的增殖率与组织块培养法获得的细胞进行比较。方法:健康新西兰大白兔12只(24只眼),无菌条件下取角膜。制备刮除羊膜上皮细胞的羊膜,上皮面向上置于35 mm培养皿备用。悬浮细胞法组(组A),即采用0.25%胰酶+0.02%EDTA混合消化液酶解角膜缘,刮取上皮细胞制成细胞悬液,均匀种植于有羊膜的35 mm培养皿体外培养;组织块培养法组(组B),选取7-8块角膜缘组织块,以1-2 mm间距分散种植于35 mm培养皿羊膜上体外培养。A、B两组培养的细胞每天在倒置显微镜下观察细胞形态、生长特点;并在培养5天后0.25%的戊二醛固定,透射电镜下计量两组细胞的桥粒数并对两组<WP=5>细胞间隙进行比较。A组细胞分别于传代于96孔板,A1组(有羊膜载体)、A2组(无羊膜载体);B组细胞分别于传代于96孔板,B1组(有羊膜载体),B2组(无羊膜载体),每组设4个平行孔,传代培养的角膜缘上皮细胞,采用MTT法分别测定1、3、5、7天的OD值,计算细胞增殖率,并进行组间比较。细胞增殖率=(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100%。比较悬浮细胞组和组织块培养传代后的细胞增殖能力及有羊膜组与无羊膜组的细胞增殖率的差别。结果:倒置显微镜观察,悬浮细胞培养法A组和组织块培养法B组扩增的角膜缘上皮细胞均能在羊膜上单层生长。A组,角膜缘上皮细胞生长均匀,排列紧密,呈多角形,细胞之间伸出突起相互接触,4-5天传一代,无梭形成纤维细胞的污染。 B组,2-3天大部分组织块边缘有细胞移行向外长出生长晕,细胞呈多角形、圆形,细胞之间相互连接。7-9天角膜缘上皮细胞传一代较A组传代时间长,且有少量梭形成纤维细胞夹杂于上皮细胞之间,当取下组织块时,存在多处无细胞空白区,不能形成连续的细胞层。透射电镜下观察,同一放大倍数视野下A组的角膜缘上皮细胞之间的间隙小于B组的细胞间隙。并且A、B两组培养的角膜缘上皮细胞之间均有桥粒连接,A组细胞的桥粒均数为3.71±0.94个(n=10);而B组细胞的桥粒均数为0.24±0.28个(n=10),两组比较且差异具有显著性 (p<0.001)。MTT法比较传代细胞的增殖率,A1组细胞培养后1、3、5、7天细胞增殖率分别是23.2 %、29.4 %、45.7 %、42.7 %;B1组在传代后培养后1、3、5、7天细胞增殖率分别是20.9 %、25.7 %、41.5 %、40.8 %,A1、B1相应各组间比较差别均有显著性(p<0.05),A1组细胞增殖率高于相应的B1组。 A2组在传代后培养后1、3、5、7天细胞增殖率分别是19.4 %、22.3 %、37.8 %、31 %。B2组在传代后培养后1、3、5、7天细胞增殖率分别是15.8 %、20.5 %、33.5 %、31 %,A2、B2相应各组间比较差别均有显著性(p<0.05),A2组细胞增殖率高于相应的B2组。且A1组细胞增殖率均高于相应的A2组, B1组细胞增殖率均高于<WP=6>相应的B2组, 两组分别均有显著的统计学差异(p<0.05)。结论:我们采用悬浮细胞培养法和组织块培养法在羊膜上成功的培养扩增了角膜缘上皮细胞。悬浮细胞培养法与组织块法比较,更易获得均匀连续、性质单一的细胞层,且同一扩大倍数电镜视野下悬浮组的角膜缘上皮细胞之间有较小的细胞间隙和较多的桥粒连接,传代培养后悬浮细胞组的细胞数量和细胞增殖能力亦显著高于组织块组。同时羊膜作为基底膜是角膜缘干细胞移植的较好载体,可以促进了角膜缘上皮的增殖,可提高培养细胞的数量。因此,以羊膜为载体悬浮细胞培养法较组织块法可以在体外获得大量均匀连续、性质单一角膜缘上皮细胞,并且传代后的细胞具有较高的增殖能力。悬浮细胞培养法结合羊膜载体对于体外获得大量的干细胞,行角膜缘干细胞移植有潜在广泛的临床应用价值,值得进一步研究。