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流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染性疾病。流感病毒属正粘病毒科，根据NP蛋白和M蛋白的不同，流感病毒可分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三种类型；根据HA和NA的不同，甲型流感病毒又可分为不同的亚型，其中HA可分为17个亚型， NA可分为10个亚型。流感病毒的亚型多，抗原变异频繁，因而研制一种能够应对流感病毒快速变异，并具有广泛保护作用的“通用型”疫苗具有重要的应用价值。 本研究构建了基于A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)流感病毒HA基因茎干部分的通用疫苗，并对其免疫原性进行了评估。 试验一流感病毒HA基因茎干部分通用疫苗的构建 本试验以A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)流感病毒基因为模板并设计4个引物，通过overlap PCR方法扩增HA基因茎干部区域HA-stem，插入到pCAGGS载体的ClaI/BglII限制性酶切位点，阳性重组质粒通过PCR、双酶切及序列测定进行鉴定。结果显示，重组质粒经PCR鉴定于1060bp处扩增出目的条带，经过双酶切获得1060bp的目的条带及4746bp的载体条带，经序列测定发现重组质粒阅读框正确，插入的片段与参考毒株CY146833.1的核苷酸序列同源性达到99％，氨基酸同源性100%，表明重组质粒构建成功，将其命名为pCAGGS-HA-stem。 试验二 pCAGGS-HA-stem体外表达与鉴定 将纯化的真核表达载体pCAGGS-HA-stem0.5ug瞬时转染到HEK-293T细胞中，转染后48h利用HA阳性血清进行间接免疫荧光检测，同时提取细胞总RNA，用DpnⅠ处理后进行RT-PCR检测目的基因的转录。结果显示，瞬时转染重组质粒的细胞出现绿色荧光，并且能够检测到HA-stem的转录，而瞬时转染空载体的细胞并未出现荧光，表明构建的重组质粒能在体外正常表达。 试验三小鼠免疫试验 将6~8周龄健康雌性 BALB/c小鼠随机分为7组，每组10只。分为pCAGGS-HA-stem免疫组及实验室以前构建的三个质粒 pCAGGS-HA、pCAGGS-HA1、pCAGGS-HA2免疫组，以及3个对照组（pCAGGS空载体组对照组、PBS对照组、健康对照组）。免疫两次。首次免疫在小鼠的双侧胫前肌注射50μg试验构建的真核表达载体，30d时再次双侧胫前肌注射50μg。免疫当天（第0天）与免疫后第60天进行小鼠眼眶采血，测定其HI抗体效价、中和抗体效价及INF-γ水平。结果显示，pCAGGS-HA、pCAGGS-HA1、pCAGGS-HA2、pCAGGS-HA-stem四个免疫组对 A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)病毒的HI抗体效价分别为1:25、1:24、1:25、1:25，中和抗体效价分别为32、19、27、24。对A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)病毒的HI抗体效价分别为1:24、1:23、1:23、1:26，中和抗体效价分别为22、13、24、22。pCAGGS-HA、pCAGGS-HA2、pCAGGS-HA-stem、pCAGGS、PBS五个组第0天INF-γ含量分别为1776.59±191.27、1777.97±252.50、1791.47±151.17、1778.65±54.14、1780.43±207.86。第60天INF-γ含量分别为2311.37±130.11、2362.40±98.24、2497.06±120.44、1799.23±65.01、1795.00±150.27。表明pCAGGS-HA-stem能够诱导对异源流感病毒的交叉保护力，尤其是对异源病毒的HI抗体效价显著高于其它组（P﹤0.05），可以作为侯选的流感通用疫苗。