第一部分小鼠成牙本质细胞终末分化过程中染色质开放区域的研究研究目的:转录因子与细胞特异性顺式调控元件如增强子、启动子等结合,调控不同生物学过程的基因表达模式。成牙本质细胞分化是牙齿形成的必要环节,同时也受到复杂的基因调控网络的控制。然而,在成牙本质细胞终末分化过程中,增强子与转录因子的相互作用仍未被完全阐明。在本研究中,我们试图通过二代测序在全基因组范围内筛选出成牙本质细胞分化过程中发挥重要作用的转录因子家族及其调控的增强子,并揭示其中所蕴含的表观遗传学机制。研究方法:利用从胚胎第18.5天（E18.5）小鼠下颌第一磨牙分离的牙乳头细胞,建立成牙本质细胞终末分化的体外模型。在诱导细胞分化前后进行了ATAC-seq,以Dmp1和Dspp显著上调为标志。同时对ATAC-seq鉴定的所有开放染色质区域中的组织特异性增强子进行H3K27ac ChIP-seq注释。同时,利用时间序列ATAC-seq分析了成牙本质细胞分化过程中特异性增强子的动态变化。最后,利用免疫组化检测终末分化中富集的转录因子ATF5在体内的表达模式,并用慢病毒介导的过表达验证ATF5在成牙本质细胞分化过程中的作用。研究结果:在分化诱导前鉴定出19755个活性增强子,GO分析显示大多数靶基因与牙齿形态发生或者牙本质形态发生相关,这表明在E18.5或之前已经决定了成牙本质细胞命运和分化潜能。然而,5422个活性增强子在诱导9天时被特异性富集,与Dspp和Dmp1的显著上调相关。此外,与这些增强子相关的基因在矿化和硬组织形成过程中显著富集,如Dmp1、Mepe和Col1a。在终末分化不同时间点的多维尺度分析（Multidimensional scaling）和k均值聚类分析（k-mean clustering）结果显示,有两组增强子具有显著的差异,其中一组增强子活性逐渐增强,另一组增强子活性逐渐减弱。Motif分析发现,ZF、Runx、Forkhead、MADS等家族的转录因子调控成牙本质细胞的早期命运决定,而b-ZIP家族的转录因子调控成牙本质细胞的终末分化。在b-ZIP家族中,ATF5在成牙本质细胞分化过程中表达量上升,过表达ATF5可以加速矿化结节的形成。在双荧光素酶实验中也证实ATF5可以激活Dmp1的增强子活性。结论:我们的研究发现ZF、Runx、Forkhead、MADS等家族的转录因子主要参与调控成牙本质细胞的早期命运决定,而成牙本质细胞的终末分化主要由b-ZIP家族调控。其中,ATF5作为b-ZIP家族的一员,可以作用于cluster 3中的增强子,从而激活Dmp1的表达,并最终促进成牙本质细胞的终末分化。第二部分RUNX2与EGR1相互作用通过Htra1的增强子调控成骨分化研究目的:Runx2作为重要的成骨细胞分化调节基因,可以通过直接或者间接的方式参与调控大量成骨相关基因的表达。然而,现有的对于RUNX2作为转录因子参与调控的靶基因主要集中于被激活的下游基因,而对于那些可能被RUNX2所抑制的基因研究不多。因此,在此项研究中,我们试图找到RUNX2所抑制的基因并深入研究其表观遗传学调控机制。研究方法:首先结合已经发表的RNA-seq和anti-RUNX2 ChIP-seq结果分析出可能被RUNX2抑制的基因,从中选择了Htra1进行后续的研究。再通过anti-RUNX2的ChIP-seq,发现在Htra1的基因组上有10个增强子的位点,并通过双荧光素酶实验确认RUNX2对这些增强子的调控作用。通过分析RUNX2在10个增强子结合位点附近的转录因子,寻找可以与RUNX2共同作用的伙伴转录因子,并且用reCHIP实验证实二者在Htra1增强子上的富集。我们通过茜素红和碱性磷酸酶染色以及碱性磷酸酶活性测定进一步确定RUNX2和EGR1在成骨分化上的协同作用。研究结果:RUNX2可以与EGR1相互作用,共同结合在Htra1增强子上,通过调控Htra1-E6的增强子活性而抑制Htra1的表达,并且同时促进成骨分化相关基因Osx,Opn,Ocn的表达。同时敲低RUNX2和EGR1的表达可以进一步抑制矿化结节的形成并降低碱性磷酸酶的活性。结论:在MC3T3-E1中,RUNX2可以与EGR1相互作用,促进成骨分化相关基因Osx,Ocn以及Opn的表达,同时抑制Htra1的增强子活性,从而促进成骨分化。