分泌性中耳炎是临床常见疾病之一，目前其发病原因及机制尚不十分清楚，被认为是多种因素造成的，包括细菌病毒感染等。脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）作为革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，研究显示它在分泌性中耳炎发病过程中起着重要作用，能够在中耳腔触发一系列炎症反应，包括激活宿主的巨噬细胞，产生大量炎性介质和生物活性物质等。许多研究已经证明脂多糖触发的中耳炎症产生大量的炎性因子还可通过圆窗或者卵圆窗感染耳蜗，引起内耳结构和功能炎性改变，破坏内耳内环境稳态的平衡。血管纹血迷路屏障（the intrastrial fluid–blood barrier）是血迷路屏障（blood-lybrinth barrier，BLB）的主要构成，虽然在调节血流量方面起着次要作用，但是在对于维持耳蜗静息电位，调控离子转运和维持内耳内环境稳态发挥着重要作用。脂多糖是如何影响血管纹血迷路屏障的，其具体机制尚不十分清楚。本次试验中，我们分别通过体内试验和体外离体模型来研究脂多糖对血迷路屏障通透性的影响及分子作用机制。　　首先我们运用聚焦离子/电子双束显微电镜（FIB/SEM）技术,获取高清血管纹血迷路屏障的超微结构图，发现血迷路屏障不仅有基质膜和内皮细胞(Endothial cell，EC)组成，还有大量的周细胞（Pericyte,PC）和血管旁定居的巨噬细胞样黑色素细胞（ perivascular-resident macrophage-like melanocytes， PVM/M）。并运用先进的VolRoverN软件进行3D重建，重建的三维图清晰地显示三种细胞的位置关系，有助于我们更好地理解血迷路屏障结构。EC被紧密连接结合在一起，形成内耳阻碍大部分血源性物质进入内耳的第一道屏障，与EC紧密相连的 PC，形成第二道防线，对血迷路屏障的完整性起着非常重要作用。PVM/M，一种既具有黑色素细胞又具有巨噬细胞特性的复杂细胞类型，借助细长的胞浆伪足与血管壁紧密连接，形成了血-迷路屏障的又一道防线。我们原代培养血管纹EC、PC和PVM/M，并利用其建立3D悬滴球体共培养模型，球体模型形成过程是细胞与细胞之间完全自发，自然的结合，不依靠任何外界支架的支持，更好地模拟了细胞的体内环境。并且我们成功建立了表达质粒载体的这三种细胞株，并进一步建立3D基质凝胶共培养模型，为后续实验奠定基础。　　在体，我们首先运用免疫组织化学、冰冻切片、石蜡切片、活体‘血管-开窗’和血管渗漏试验等方法研究脂多糖对小鼠血管纹血迷路屏障的影响，我们的研究结果显示，LPS可引起血管渗漏。LPS诱发的局部感染可以改变血管纹血迷路屏障的PC和PVM/M的形态和特性，影响血迷路屏障的完整性。进一步我们结合荧光实时定量多聚酶链反应(real-time fluorescence quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、蛋白印迹(western blot)和透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)等方法观察LPS对血管纹血迷路屏障紧密连接相关蛋白的影响。结果表明，脂多糖可通过改变血管纹血迷路屏障组成细胞PC和PVM/M的形态和特性，调控紧密连接相关蛋白的表达，影响血管纹血迷路屏障的通透性。且与先前报道结果相一致，本研究结果显示脂多糖可引起高频听力损失。　　离体，我们利用原代培养血管纹EC建立EC单层培养模型，脂多糖处理不同时间，发现LPS处理组EC单层对小分子荧光物质FITC-dextran的渗透率较正常对照组明显升高，更进一步我们结合实时定量多聚酶链反应，in cell western，免疫细胞荧光等方法研究脂多糖对内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响，与体内研究结果一致，脂多糖下调 EC间紧密连接相关蛋白的表达,如 ZO-1, occludin和ve-cadherin。并且我们运用3D基质凝胶细胞共培养模型，模拟正常体内生理环境，结合共聚焦显微镜，观察病理条件下（脂多糖处理）PC和PVM/M对血管生成和稳定性的影响，结果显示脂多糖引起PC‘迁移’，激活PVM/M引起形态学和性能改变，降低了PC和PVM/M对血管的生成和稳定作用，引起血管网支架不稳定，加速血管网支架降解。　　本研究分为三个部分：　　第一部分：小鼠血管纹血迷路屏障的细胞组成和在血迷路屏障中的分布　　目的：　　分析血管纹血迷路屏障的细胞组成和分布特点，原代培养血管纹 EC、PC和PVM/M并进行质粒转染，建立稳定表达质粒转染的细胞株，建立3D细胞共培养模型，为下一步的功能研究提供基础依据。　　方法：　　分离血管纹，运用聚焦离子/电子双束显微电镜(FIB/SEM)技术,获取高清血管纹血迷路屏障超微结构图，运用先进的VolRoverN软件进行3D重建。离体，利用实验室已经建立的方法从小鼠耳蜗血管纹组织选择性获取血迷路屏障EC、PC和PVM/M进行原代培养，并分别用三种不同颜色的细胞荧光探针标记三种细胞系后建立3D悬滴球体共培养模型。进一步，用pE2-Crimson-N1质粒载体转染EC、pmOrange2-N1载体转染PC、pEGFP-N2载体转染PVM/M，筛选稳定转染的细胞，冻存备用，并利用转染成功的细胞建立体外3D基质凝胶共培养模型，为更好研究血迷路屏障提供技术基础。　　结果：　　1血管纹血迷路屏障的形态和构成　　通过 FIB/SEM获得高清血管纹超微结构图,细胞边缘可以自动分割出来， PVM/M、PC和EC之间的相互作用联系被描出和量化，并运用先进的VolRoverN软件进行3D重建，重建的结构图清晰显示三种细胞的位置关系，有助于我们更好理解血迷路屏障结构。　　23D悬滴球体共培养系统建立　　利用实验室已经建立的方法，进行原代培养血管纹EC、PC和PVM/M，并分别用带有不同颜色的荧光探针标记这三种细胞，建立3D悬滴球体共培养模型。　　3成功建立分别表达 pE2-Crimson-N1、pmOrange2-N1、 pEGFP-N2质粒载体的三种细胞株，并利用转染细胞建立3D基质凝胶共培养模型。　　成功建立表达pE2-Crimson-N1载体的血管纹EC株,表达pmOrange2-N1的血管纹PC株,表达pEGFP-N2载体的血管纹PVM/M株,利用转染细胞建立3D基质凝胶共培养模型。　　结论：　　本文运用FIB/SEM获得了血管纹血迷路屏障的高清超微结构图，并运用先进的VolRoverN软件进行3D重建，清晰的显示三种细胞的位置关系，有助于我们更好理解血迷路屏障结构。可见血迷路屏障除了由基质膜和EC构成外，该屏障周围还有大量的周细胞（pericyte,PC）和血管旁定居的巨噬细胞样黑色素细胞（perivascular resident macrophage，PVM/Ms）。3D悬滴球体共培养模型能更好模拟细胞的体内环境，更有利于观察血迷路屏障三种组成细胞之间的作用关系。成功建立稳定表达pE2-Crimson-N1载体的血管纹EC株,表达pmOrange2-N1载体的血管纹PC株,表达pEGFP-N2载体的PVM/Ms株,利用转染细胞成功建立了3D基质凝胶共培养模型，为我们后续实验奠定基础。　　第二部分：内毒素脂多糖对血迷路屏障影响的在体研究　　目的：　　通过体内实验探讨内毒素脂多糖对血迷路屏障的影响及具体作用机制。　　方法：　　通过鼓膜注射内毒素脂多糖建立中耳炎模型，结合冰冻切片，免疫荧光化学方法评估中耳炎模型的建立，通过活体‘血管-开窗’的方法结合荧光显微镜在体观察内耳血迷路屏障对荧光物质 albumin-FITC渗透性的变化，分离血管纹，荧光定量分析残留荧光，比较对照组和 LPS处理组血管纹血迷路屏障的通透性变化。听性脑干反应测听评估 LPS处理后听功能状态的改变。石蜡切片结合共聚焦荧光显微镜观察中耳炎模型内耳形态的变化。免疫组织化学的方法结合共聚焦荧光显微镜，观察脂多糖对血管纹血迷路屏障PC和PVM/M的影响。通过荧光实时定量多聚酶链反应、蛋白质印迹、透射电镜方法观察脂多糖对血管纹紧密连接相关蛋白ZO-1, occludin,和VE-cadherin表达水平的影响。　　结果：　　1脂多糖诱导中耳炎模型的评估　　脂多糖导致鼓膜和中耳粘膜增厚水肿，中耳腔和鼓膜大量F4/80阳性炎性细胞浸润。　　2脂多糖可引起听力损失　　正常对照组在所有测试频率均显示出极好的听力阈值。LPS处理组，在多个测试频率都出现听力阈值的明显升高。　　3内淋巴水肿　　石蜡切片结果显示，正常对照组耳蜗顶转、中转和底转都未见内淋巴水肿， LPS处理组耳蜗顶转和中转见轻度内淋巴水肿，Reissner’s膜处可见褶皱。　　4脂多糖对血迷路屏障通透性的影响　　脂多糖导致血迷路屏障高通透性。正常对照组，活体荧光显微镜下未见血管网albumin-FITC渗出，LPS处理组血管网见多处albumin-FITC渗出。分离整个血管纹，LPS处理组albumin-FITC残留比正常对照组显著升高。　　5脂多糖引起PC迁移和PVM/M的激活从而影响血管纹血迷路屏障完整性。　　正常对照组，PC展示出扁平、细长的形态且与EC紧密接触；而在LPS处理组，PC呈明显的圆形胞体，可见有细胞迁移脱离血管壁，并释放大量颗粒。PVM/M在正常小鼠呈现细长树枝状，细胞膜表面无终端半乳糖基团的附着， GS-IB4阴性。然而48小时LPS处理后，细胞突起缩短，一些细胞变性，类似变形虫样形态，部分细胞被激活，与GS-IB4紧密结合，GS-IB4阳性。　　6脂多糖对血管纹血迷路屏障紧密连接蛋白表达的影响。　　mRNA水平，血管纹内 ZO-1、occludin和 VE-cadherin表达水平脂多糖处理48小时后较正常对照组明显减低(n=3; P<0.01)，mRNA表达降低的同时，western blot结果显示蛋白表达水平同样也显著降低(n=3;P<0.05)。　　7透射电镜下紧密连接形态学改变　　透射电镜下见正常对照组血管纹 EC之间广泛、致密的紧密连接，而 LPS处理组紧密连接明显减少。　　结论：　　1．脂多糖可引起听力损伤。　　2．脂多糖导致内淋巴水肿。　　3．脂多糖诱发的中耳炎症下调紧密连接蛋白ZO-1，occludin，和VE-cadherin的表达，引起血迷路屏障组成细胞周细胞的迁移和血管旁定居的巨噬细胞样黑色素细胞的激活，导致周细胞和血管旁定居的巨噬细胞样黑色素细胞的形态和特性改变，破坏血迷路屏障的完整性，引起血管渗漏，破坏内耳平衡，参与血迷路屏障通透性增高的发病机制。　　第三部分：内毒素脂多糖对血迷路屏障影响的离体研究　　目的：　　通过体外实验探讨内毒素脂多糖对血迷路屏障的影响及具体作用机制。　　方法：　　复苏前述冻存的三类血迷路屏障来源的细胞，运用EC建立体外EC单层模型，离体观察脂多糖作用下EC单层对荧光物质FITC-dextran通透性的变化。并利用细胞免疫荧光的方法结合共聚焦荧光显微镜观察脂多糖对这三种细胞的影响，建立3D基质凝胶共培养模型，模拟正常体内生理环境，结合共聚焦显微镜，观察病理条件下（脂多糖处理）PC和PVM/M对血管生成和稳定性的影响。利用原代培养的EC建立体外EC单层模型，结合免疫细胞化学、蛋白质印迹和荧光实时定量多聚酶链反应等方法观察脂多糖对紧密连接蛋白 ZO-1, occludin,和VE-cadherin表达水平的影响。　　结果：　　1脂多糖对血管纹EC单细胞层通透性的影响　　利用实验室已经建立的方法培养EC并建立EC单细胞层模型，LPS处理结果显示，处理2h即开始出现 FITC-dextran渗透率增高，随着时间延长， FITC-dextran渗透率逐渐增高。　　2脂多糖导致PC和血管旁定居的巨噬细胞样黑色素细胞形态学改变。　　正常PC呈个大、扁平具有宽伪足的星形形态，而经LPS处理后PC分支增多，并释放大量的颗粒。与在体结果相一致，LPS处理后血管旁定居的巨噬细胞样黑色素细胞细胞突起变短，部分细胞被激活， GS-IB4阳性.　　3脂多糖降低了 PC和血管旁定居的巨噬细胞样黑色素细胞对血管的生成和稳定作用。　　正常组PC与EC形成的‘血管网’紧密相贴，未见细胞迁移，LPS处理组，见PC脱离‘血管支架’，发生迁移。正常组，PVM/M，从胞体发出细长的突起，紧紧包绕EC形成的‘血管网’，血管支架稳定，LPS组，突起缩短，胞体变小，支架不稳定，‘血管网’支架破坏。　　4脂多糖对EC单层紧密连接蛋白表达的影响。　　在mRNA水平，occludin和 VE-cadherin在LPS2h组、8h组和24h组较正常对照组均明显降低，zo-1mRNA表达水平在LPS8h和LPS24h组明显降低。mRNA表达水平降低的同时，in cell western结果显示三者在LPS24h组蛋白水平的表达同样有显著降低。此外,共聚焦显微镜拍摄的免疫组化照片清楚的显示LPS处理下 EC单细胞层模型细胞之间的紧密连接相关蛋白密度明显降低，EC之间的间隙变大。　　结论：　　1脂多糖可引起 PC‘迁移’，激活血管旁定居的巨噬细胞样黑色素细胞,引起细胞形态和性能改变，降低了PC和PVM/M对血管的生成和稳定作用，导致3D基质凝胶模型中内皮细胞形成的血管网支架破坏。　　2与体内研究结果一致，脂多糖下调 EC之间紧密连接相关蛋白的表达从而导致血管纹内皮细胞单层通透性增高。