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目的:探索补体C3a/C4a及恒定型自然杀伤T(Invariant nature killer T,iNKT)细胞对多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)患者破骨细胞的作用及机制。内容:通过检测初治多发性骨髓瘤(Newly diagnosed multiple myeloma,NDMM)患者和健康对照外周血C3a/C4a水平及iNKT细胞数量,并与骨病分期、成骨细胞前体(Osteoblast precursors,OBPs)和破骨细胞前体(Osteoclast precursors,OCPs)数量及骨髓瘤骨病(Myeloma bone disease,MBD)生物学指标水平作相关性分析,初步探讨C3a/C4a及iNKT细胞对MBD发生的作用。通过在体外诱导单个核细胞形成破骨细胞的培养体系中加入C3a/C4a或α-半乳糖神经酰胺(α-galactosylceramide,α-GalCer)(即iNKT细胞的特异性激活扩增剂),并检测破骨细胞数量、功能及其相关基因/蛋白的表达水平,进一步明确C3a/C4a及iNKT细胞对MM患者破骨细胞的作用及可能机制。方法:第一部分补体C3a/C4a对MM患者破骨细胞的作用及机制研究。1.NDMM患者血清C3、C4和C4a水平与骨病严重程度相关性探讨:速率散射比浊法检测血清C3/C4水平;酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清C4a及抗酒石酸盐酸性磷酸酶-5b(Tartrate-rsistant acid phosphatase isoform-5b,TRACP-5b)水平;电化学发光免疫试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ECLIA)检测血清骨钙素(Osteocalcin,OCN)/总I型前胶原氨基端前肽(Procollagen I amino-terminal propeptide,PINP)/I型胶原蛋白交联羧基末端肽(Carboxy-terminal cross-linking telopeptide of type I collagen,CTX)水平;流式细胞术检测OBPs/OCPs数量;对NDMM骨病严重程度进行分级;将NDMM血清C3、C4和C4a水平与骨病严重程度分级、OBPs/OCPs数量、骨重建相关生物学标志物OCN/PINP及骨破坏相关生物学标志物CTX/TRACP-5b水平作相关性分析。2.在体外细胞水平上探讨C3a/C4a对NDMM患者破骨细胞形成及功能的影响:将NDMM患者骨髓单个核细胞分为实验组(加入C3a/C4a)和对照组(相同体积二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)),利用巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor,M-CSF)和核因子κB受体活化配体(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL)诱导单个核细胞形成破骨细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色鉴定后利用光镜观察破骨细胞每视野下融合面积并进行比较分析;qRT-PCR检测破骨细胞相关基因RANKL/破骨细相关受体(Osteoclast Associated Receptor,OSCAR)/TRAP/组织蛋白酶K(Cathepsin K)mRNA表达水平并进行比较分析;在灭菌的牛骨切片上诱导形成破骨细胞骨陷窝,利用扫描电镜观察每视野下骨陷窝吸收面积并进行比较分析。3.探讨并验证C3a/C4a对NDMM患者破骨细胞作用的相关信号通路:将NDMM患者骨髓单个核细胞分为实验组(加入C3a/C4a)和对照组(相同体积DMSO),利用M-CSF和RANKL诱导单个核细胞形成破骨细胞并提取总RNA,通过RNA-Seq检测加补体组与对照组诱导出的破骨细胞之间的差异基因,并分析出可能的信号通路;利用qRT-PCR、Western blot及通路抑制剂进一步验证。第二部分iNKT细胞对MM患者破骨细胞的作用及机制研究。1.NDMM患者iNKT细胞及其分泌的细胞因子与骨病严重程度相关性探讨:流式细胞术检测NDMM患者和健康对照外周血中iNKT细胞及其各亚群细胞数量、OBPs/OCPs数量及iNKT细胞分泌因子IFN-γ/TNF/IL-4/L-13水平;ECLIA检测血清OCN/PINP/CTX水平;对NDMM骨病严重程度进行分级;将NDMM患者iNKT细胞数量及其分泌因子IFN-γ/TNF/IL-4/IL-13水平与骨病严重程度分级、OBPs/OCPs数量、骨重建相关生物学标志物OCN/PINP和骨破坏相关生物学标志物CTX水平作相关性分析。2.在体外细胞水平上探讨NDMM患者和健康对照iNKT细胞在α-GalCer刺激作用下的扩增水平及iNKT细胞对破骨细胞的作用:将NDMM患者及健康对照外周血单个核细胞分为实验组(加入α-GalCer)和对照组(相同体积DMSO),培养14天,在第0/7/14天利用流式细胞术检测iNKT细胞数量并作比较分析;利用M-CSF和RANKL诱导单个核细胞形成破骨细胞,TRAP染色鉴定后利用光镜观察,记录破骨细胞数量并进行比较分析。3.探索iNKT细胞对破骨细胞作用的可能机制:通过ELISA检测共培养上清液中细胞因子水平;将NDMM患者及健康对照外周血单个核细胞分为实验组(加入α-GalCer或/和人重组细胞因子/细胞因子阻断剂)和对照组(相同体积DMSO),利用M-CSF和RANKL诱导单个核细胞形成破骨细胞,TRAP染色鉴定后利用光镜观察,记录破骨细胞数量并进行比较分析;qRT-PCR检测破骨细胞相关基因TRAP/OSCAR/RANKL mRNA表达水平并进行比较分析。结果:第一部分补体C3a/C4a对MM患者破骨细胞的作用及机制研究。1.NDMM患者血清中C3、C4和C4a水平与骨病严重程度、OCPs数量、骨破坏相关生物学标志物CTX和TRACP-5b水平呈明显正相关。2.在体外细胞水平上,NDMM患者C3a浓度为1μg/ml组(52.794±13.027%)和10μg/ml组(51.797±12.464%)诱导出的破骨细胞每视野下的融合面积明显比对照组(0μg/ml)(33.668±8.427%)增大(P<0.001;P<0.001);浓度为1μg/ml组(中位数5.041;3.726;1.638;4.752)和10μg/ml组(中位数5.140;3.702;2.250;5.172)诱导出的破骨细胞相关基因OSCAR/TRAP/RANKL/Cathepsin K mRNA相对表达量明显比对照组(0μg/ml)(中位数3.137;2.004;0.573;2.257)增高(1μg/ml组P=0.001;P=0.003;P<0.001;P=0.008;1μg/ml组P<0.001;P=0.019;P<0.001;P=0.002);浓度为1μg/ml组(51.464±11.983%)和10μg/ml组(50.219±12.067%)诱导出的破骨细胞骨陷窝每视野下的吸收面积明显比对照组(0μg/ml)(33.845±8.331%)增大(P<0.001;P<0.001)。而在C4a实验中,诱导出的破骨细胞融合面积、相关基因相对表达量及骨陷窝吸收面积在对照组(0μg/ml)、浓度为1μg/ml和10μg/ml组三组之间无统计学差异。3.将4位NDMM患者C3a浓度为1μg/ml组和0μg/ml组诱导出的破骨细胞总RNA进行RNA-Seq检测,测序结果显示有184个组间差异基因,差异基因KEGG Pathway富集气泡图显示C3a可能通过磷酸肌苷3-激酶(Phosphoinositide3-kinase,PI3K)信号通路(包括PI3K-Akt依赖的信号通路和PI3K非Akt依赖的信号)促进破骨细胞增殖,选取这个通路上至少在3位测序患者中表达上调的差异基因进行qRT-PCR和Western Blot验证,发现基因磷酸肌醇依赖激酶1(Phosphoinositide dependent kinase-1,PDK1)和血清糖皮质激素诱导蛋白激酶3(Serum and glucocorticoid inducible protein kinases,SGK3)的相对表达量在C3a组(1μg/ml)(中位数2.078;4.428)明显高于对照组(0μg/ml)(中位数1.336;1.714)(P<0.001;P=0.001),蛋白P-SGK3和PDK1的相对灰度在C3a组(1μg/ml)(1.785±0.323;2.190±0.274)明显强于对照组(0μg/ml)(0.8653±0.588;0.176±0.152)(P=0.034;P<0.001);在均有C3a作用下,NDMM患者SGK抑制剂EMD638683 1μM组(39.244±9.089%)和10μM组(39.299±9.587%)破骨细胞每视野下的融合面积明显比对照组(0μM)(54.884±12.837%)减小(P<0.001;P<0.001),EMD638683 1μM组(中位数0.869;1.097;0.902;1.328)和10μM组(中位数0.703;1.391;0.843;1.418)破骨细胞相关基因OSCAR/RANKL/TRAP/Cathepsin K mRNA相对表达量明显比对照组(0μM)(中位数2.270;3.024;2.208;3.237)降低(1μM组P=0.015;P=0.002;P=0.003;P=0.015;10μM组P=0.012;P=0.006;P<0.001;P=0.017),EMD638683 1μM组(35.383±7.794%)和10μM组(32.886±8.993%)破骨细胞骨陷窝每视野下的吸收面积明显比对照组(0μM)(49.358±11.856%)减小(P<0.001;P<0.001)。第二部分iNKT细胞对MM患者破骨细胞的作用及机制研究。1.NDMM患者的iNKT细胞及CD4~-CD8~+和DN iNKT细胞亚群数量明显降低,并且分泌Th1因子(IFN-γ和TNF)减少,而Th2因子(IL-4和IL-13)增多。骨病C期NDMM患者的iNKT细胞(包括CD4~-CD8~+iNKT细胞)数量及其分泌IFN-γ水平要明显低于骨病A/B期和健康对照,并且iNKT细胞数量及其分泌IFN-γ水平与骨破坏相关生物标志物CTX水平和OCPs数量呈明显负相关。2.健康对照组在第7天和14天,α-GalCer刺激下iNKT细胞扩增的数量明显比对照组(相同体积DMSO)增高(第7天:2.359±0.267%vs 0.451±0.046%,P<0.001;第14天:4.584±0.362%vs 1.490±0.188%,P<0.001),而NDMM患者α-GalCer刺激iNKT细胞扩增作用不明显;健康对照组α-GalCer刺激下产生的破骨细胞数量明显比对照组(相同体积DMSO)减少(512±32个/2cm~2 vs 758±55个/2cm~2,P=0.001),而NDMM患者α-GalCer刺激下产生的破骨细胞数量比对照组(加同体积的DMSO)有减少趋势,但无统计学意义。3.健康对照组α-GalCer刺激下的iNKT细胞与破骨细胞共培养上清中的IFN-γ水平第7/14天比对照组(相同体积DMSO)均增高。健康对照中加入α-GalCer和IFN-γ阻断剂(即anti-IFN-γ/α-GalCer组)(719±45个/2cm~2)诱导出的破骨细胞数量明显比加入α-GalCer(即α-GalCer组)(542±31个/2cm~2)(P=0.009)增多,anti-IFN-γ/α-GalCer组(中位数1.443/1.307/6.132)破骨细胞相关基因TRAP/OSCAR/RANKL mRNA相对表达量也明显比α-GalCer组(中位数0.238/0.322/0.642)增高(P=0.007,P=0.002,P=0.025);NDMM患者中IFN-γ/α-GalCer组(529±37个/2cm~2)诱导出的破骨细胞数量明显比α-GalCer组(765±36个/2cm~2)(P<0.001)和对照组(相同体积DMSO)(805±44个/2cm~2)(P<0.001)减少,IFN-γ/α-GalCer组(中位数0.076)破骨细胞相关基因RANKL mRNA相对表达量也明显比α-GalCer组(中位数5.807)(P=0.036)和对照组(中位数11.433)(P=0.029)降低。结论:补体C3a通过增强PI3K信号通路上SGK3磷酸化来激活MM患者的破骨细胞,进而促进骨病发生,SGK抑制剂对MM患者破骨细胞有明显的抑制作用。iNKT细胞是通过分泌IFN-γ来抑制破骨细胞形成,NDMM患者中iNKT细胞的数量和功能均存在缺陷导致这一调节功能受损,进而促进MBD发生。以上研究为寻找新的MBD治疗靶点和策略提供了重要依据。