【摘 要】
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外源基因在大肠杆菌中的表达量与序列本身密切相关,如密码子的偏好性,mRNA的二级结构和信号肽等。本文通过DNA分析程序,对海栖热袍菌α-葡萄糖醛酸酶基因进行分析,通过定点诱变和定向改造技术对翻译起始区稀有密码子以及基因内部mRNA二级结构进行优化。得到一系列突变基因并将它们成功的插入到表达载体pTrc99A和pHsh中得到重组质粒。通过对基因内部mRNA二级结构的最小自由能优化得到突变基因aguA
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外源基因在大肠杆菌中的表达量与序列本身密切相关,如密码子的偏好性,mRNA的二级结构和信号肽等。本文通过DNA分析程序,对海栖热袍菌α-葡萄糖醛酸酶基因进行分析,通过定点诱变和定向改造技术对翻译起始区稀有密码子以及基因内部mRNA二级结构进行优化。得到一系列突变基因并将它们成功的插入到表达载体pTrc99A和pHsh中得到重组质粒。通过对基因内部mRNA二级结构的最小自由能优化得到突变基因aguA3,aguA4,aguA5,aguA34,aguA345。实验结果说明以上五个突变基因以及原始基因在两个不同的载体中表达水平呈现相似的趋势,不同的载体与内部突变基因分别影响表达水平。通过翻译起始区密码子优化得到突变基因aguA1,在不同载体中分别为重组质粒pTrc99A-aguA1,pHsh-aguA1。重组质粒pTrc99A-aguA1的表达比原始基因在pTrc99A中的表达要低60%为0.37×10-2U/mL·OD600,而pHsh-aguA1的表达水平则比原始基因提高了55%为0.25U/mL·OD600。分析原因得出结论是转录起始区的mRNA二级结构对表达水平有着较大的影响。实验结果表明,基因内部少数几个碱基突变会较大影响表达水平,实验结果以及目前的国内外研究进展均无法详细解释其中的生物学机理,这方面还有待于进一步研究。
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