【摘 要】
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目的:制备负载去甲斑蝥素（NCTD）的纳米粒及构建共载去甲斑蝥素纳米粒（NCTD-NPs）和阿霉素（Dox）的温敏性水凝胶体系,并通过体外、体内实验研究该体系对肝细胞肝癌的治疗作用。方法:本研究通过ε-己内酯的开环聚合反应制备聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯（PCL-PEG-PCL,PCEC）,再以PCEC聚合物作为载体,采用薄膜分散的方法制备NCTD-NPs。然后将NCTD-NPs与Dox一起包封在
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目的:制备负载去甲斑蝥素（NCTD）的纳米粒及构建共载去甲斑蝥素纳米粒（NCTD-NPs）和阿霉素（Dox）的温敏性水凝胶体系,并通过体外、体内实验研究该体系对肝细胞肝癌的治疗作用。方法:本研究通过ε-己内酯的开环聚合反应制备聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯（PCL-PEG-PCL,PCEC）,再以PCEC聚合物作为载体,采用薄膜分散的方法制备NCTD-NPs。然后将NCTD-NPs与Dox一起包封在基于Pluronic F127（PF127）的温敏性水凝胶中,构建了双重载药水凝胶体系。采用透射电镜（TEM）和动态光散射法（DLS）对NCTD-NPs的形貌及粒径进行表征,利用高效液相色谱仪检测NCTD-NPs的载药率和包封率,通过荧光摄取实验研究细胞对PCEC纳米粒的摄取情况,采用旋转流变仪研究载药水凝胶体系的流变特性,通过透析法对NCTD-NPs、载药水凝胶体系的体外药物释放进行研究,体外细胞毒性实验（MTT法）研究空白PCEC纳米粒和载药水凝胶体系对Hep G2细胞的毒性作用。然后,建立肝癌H22细胞皮下移植瘤模型,并随机分为4组（n=10）:生理盐水组（NS组）、空白水凝胶组、游离药物组（NCTD+Dox）和载药水凝胶体系组。然后,采用肿瘤内注射的给药方式进行分组治疗,并监测各组荷瘤小鼠的体重变化、肿瘤体积及生存时间。治疗结束后,每组处死一半的小鼠,收集肿瘤组织及重要器官组织,采用苏木精和伊红（H&E）染色评估肿瘤的坏死情况及药物对小鼠的系统毒性,并通过免疫组化测定肿瘤组织中Ki-67和CD31的表达水平。结果:采用薄膜分散的方法成功制备NCTD-NPs,呈球形颗粒,粒径为88.5±1.8 nm,具有较高的载药率及包封率,分别为8.80±0.42%、88.03±4.23%。荧光摄取实验:生理盐水组及空白纳米组呈黑色,无荧光显示;游离香豆素6组和载香豆素-6纳米粒（C6-NPs）组显示出明显的荧光,且C6-NPs组的荧光强度明显强于游离香豆素6组。制备的载药水凝胶体系具备较好的温敏性,室温下为溶胶状态,体温下迅速变成不流动的凝胶状态。体外释放实验:游离NCTD组的药物迅速被释放至介质中,然而,NCTD-NPs组和载药水凝胶体系组中的药物都能以缓慢、持续的方式释放,且无明显的突发释放行为。细胞毒性实验:空白PCEC纳米粒的毒性作用较弱,可作为一种安全的药物载体;此外,当Dox的浓度大于1μg/m L时,载药水凝胶体系的细胞毒性显著高于游离药物。体内实验结果表明,治疗结束后,载药水凝胶体系组肿瘤体积为378.84±150.32mm3,显著小于NS组（1086.72±473.92 mm3,p<0.01）、空白水凝胶组（990.57±491.24 mm3,p<0.01）和游离药物组（624.59±315.59 mm3,p<0.05）的肿瘤体积,且差异具有统计学意义。载药水凝胶体系组中小鼠的中位生存期为67天,明显长于NS组（41天）、空白水凝胶组（45天）和游离药物组（53天）,且差异具有统计学意义（均P<0.05）。通过H&E染色观察小鼠重要器官（心、肝、脾、肺和肾）,无明显的组织损伤或病变。肿瘤组织H&E染色显示,游离药物组和载药水凝胶体系组的切片可见较多的坏死区域。免疫组化分析显示,载药水凝胶体系组Ki-67阳性率（22.46±2.51%）明显低于NS组（85.16±3.41%,P<0.01）、空白水凝胶组（84.37±2.97%,P<0.01）和游离药物组（38.77±4.85%,P<0.05）;同样地,载药水凝胶体系组微血管密度（7.67±0.94）明显低于游离药物组（15.34±2.05,P<0.05）、空白水凝胶组（33.34±3.30,P<0.01）和NS组（34.67±2.87,P<0.01）。结论:双重载药水凝胶体系具备较好的温敏性特性和药物缓释特性。通过肿瘤内注射给药的方式,载药水凝胶体系相比于游离药物,能更有效地抑制肝癌皮下移植瘤的生长,并延长小鼠的中位生存期。同时,载药水凝胶体系没有表现出明显的系统毒性,并且可以减少游离药物的毒副作用,是一种有效、安全的局部化疗药物递送体系。
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