【摘 要】
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(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((R)-CHBE)是重要的手性中间体,利用羰基还原酶催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)发生不对称加氢还原反应制备(R)-CHBE是很有潜力的合成方法。文献调研发现存在高比活氧化还原酶但都申请过专利保护,并且目前鲜见对羰基还原酶进行分子改造以提高其催化活性的报道。本研究利用基因挖掘技术构建具有自主知识产权的高比活氧化还原酶,再对其进行分子改造和产酶优化,并构建了双菌
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(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((R)-CHBE)是重要的手性中间体,利用羰基还原酶催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)发生不对称加氢还原反应制备(R)-CHBE是很有潜力的合成方法。文献调研发现存在高比活氧化还原酶但都申请过专利保护,并且目前鲜见对羰基还原酶进行分子改造以提高其催化活性的报道。本研究利用基因挖掘技术构建具有自主知识产权的高比活氧化还原酶,再对其进行分子改造和产酶优化,并构建了双菌双酶耦联催化体系实现辅酶再生,主要研究结果如下:(1)利用基因挖掘技术构建了羰基还原酶酶库,筛选获得一个对COBE具有较高催化活力的羰基还原酶KY(来源于Rhodotorula mucilaginosa),粗酶活为3.60U/mL,比酶活为 72.57U/mg;(2)利用半理性设计对KY进行分子改造。利用易错PCR构建随机突变文库,借助高通量筛选方法获得4个酶活提高的阳性突变体,经测序发现157位和213位是影响酶活的关键位点。对157位和213位分别进行定点饱和突变,得到5个阳性突变体,酶活分别是野生型KY的1.23～1.82倍;最后将157位和213位所有的阳性突变体进行组合突变,得到优势突变体KY(T157S/G213P),粗酶活为7.10U/mL,比酶活为138.42U/mg,提高至野生型KY的1.91倍。(3)通过更换质粒载体和N端增加融合标签,构建了重组质粒pET22b-KY(T157S/G213P,SKIK),粗酶活为24.51U/mL。其次,通过培养条件优化和诱导条件优化,粗酶活提高至53.11 U/mL。(4)利用羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶构建双菌双酶耦联催化反应体系,用于辅酶NADPH再生。35℃、200rpm条件下,在以磷酸盐缓冲液(0.1 mM,pH=7.5)为介质的反应体系中,当COBE浓度为0.24 M,葡萄糖浓度为0.24M,NADP+浓度为 0.01 mM,KY(T157S/G213P,SKIK)和 BsGDH 的加量均为 12 U/mL 时,反应14h后,底物基本可以转化完全。
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