抗番鸭呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备

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番鸭呼肠孤病毒病是由呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duckreovirus,MDRV)引起的番鸭病毒性传染病。是一种高发病率、高致死率的番鸭传染病。自暴发以来,已给番鸭业造成严重的经济损失,成为制约我国番鸭业健康发展的主要疫病之一。该病毒是一类RNA病毒,病毒粒子呈球形或近球形,直径60nm~73nm,正二十面体,立体对称、无囊膜,有可见的双层衣壳结构。由分节段的10个基因片段组成,病毒编码10个蛋白,包括构成衣壳结构的8个结构蛋白和2个非结构蛋白,共分为λ、μ和σ三组。其中对σC蛋白研究的较为成熟,它是引起免疫原性的主要结构蛋白。但近年来也有人研究发现其中非结构蛋白σB与结构蛋白σC联合免疫,能取的更好的效果。但关于σB蛋白作用机理在国内外还未见报道。本试验利用实验室已构建好的重组pET30-σB质粒,转化到E.coli BL21(DE3)大肠杆菌中进行了σB蛋白的表达,其分子量为45kDa,与预期大小一致,利用pET-30a载体带有的His-tag选择性标签,纯化蛋白,以纯化蛋白为抗原,番鸭呼肠孤病毒阳性血清为一抗进行Western blots分析:表明σB蛋白能与抗番鸭呼肠孤病毒阳性血清发生特异性反应,说明蛋白具有良好的免疫原性。将表达纯化的原核蛋白进行透析复性,免疫8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠,制备抗番鸭呼肠孤病毒σB蛋白的单克隆抗体,通过一系列基本鉴定,初步确定了4株单克隆细胞杂交瘤,分别命名为A3F,B2B,C3E,D2G,同时利用杆状病毒在Sf9细胞中表达的具有天然结构的蛋白。对4株单抗进行了免疫组化鉴定。结果表明四株单抗均与天然构像的蛋白反应,具有很好的利用价值。同时对单抗进行了初步的表位分析,其中A3F株针对前1-34aa短肽,B2B,C3E株针对1-80aa短肽,D2G株针对34-80aa短肽。
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