论文部分内容阅读
蓖麻毒素（Ricin Toxin,RT）为提取自蓖麻种子的植物毒素,属于Ⅱ型核糖体活性抑制剂,含有A亚基（Ricin Toxin A chain,RTA）和B亚基（Ricin Toxin B chain,RTB）。蓖麻毒素具有制备成本低廉、性质稳定、多种中毒途径和无特效解毒药等特点。蓖麻毒素作为生物战剂和恐怖剂,严重威胁公共安全。目前蓖麻毒素无任何解毒剂,特异性抗体治疗可能成为一种高效的治疗方法。单链抗体（single chain antibody fragment,sc Fv）具有亲本单克隆抗体对于抗原的高亲和力、高特异性等优势,还拥有体内免疫原性低、容易透过体内的屏障组织等诸多优点。应用噬菌体抗体库技术,将单链抗体基因重组至噬菌粒的特定位置,通过将单链抗体与噬菌体的外壳蛋白融合表达,最终得到噬菌体抗体。不但避免繁琐的免疫和细胞操作,并且易于对抗体改造,有利于提高抗体的亲和力。本研究为制备特异性抗蓖麻毒素的全人源单链抗体进行相关探索,主要包括以下四部分内容:1.全人源抗蓖麻毒素单链抗体的筛选本研究通过对Tomlinson I+J噬菌体抗体库循环4轮“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的富集筛选,成功筛选得到全人源抗蓖麻毒素单链抗体JE11。通过PCR和phage ELISA抗原交叉反应,对得到的阳性克隆进一步鉴定,筛选得到阳性率较高且假阳性率较低的克隆JE11。设计引物对筛选得到的JE11序列进行Ig BLAST,证明单链抗体为人源抗体,其VH属于VHⅢ亚群,VL为κ链,属于VκⅠ亚群。2.全人源抗蓖麻毒素单链抗体的表达工艺研究为确定制备全人源抗蓖麻毒素单链抗体的最优表达工艺,本研究通过SDS-PAGE和灰度分析,对比不同表达条件下的单链抗体表达量,确定JE11工程菌的最优诱导表达条件为:以0.5 mmol/L IPTG浓度,37℃诱导12 h。通过金属螯合层析和离子交换层析对单链抗体粗提液进行纯化,利用薄层扫描分析产物的纯度变化,最终确定JE11包涵体的纯化方法为:先用金属螯合亲和层析以50 mmol/L咪唑洗脱杂蛋白,以100 mmol/L咪唑洗脱目的蛋白。然后用p H=7.2的平衡液使目的蛋白通过阴离子交换层析柱,目的蛋白以流穿形式流出。本研究获得97.88%纯度的JE11抗体,为下一步体内外实验验证奠定了基础。3.全人源抗蓖麻毒素单链抗体的生物学活性研究本研究利用ELISA法验证人源抗RT单链抗体JE11对RT呈剂量依赖性的特异性结合,其线性率R2为95.23%。另外,通过Western Blot实验进一步验证人源抗RT单链抗体JE11对RT的特异性结合。通过MTT验证10μg/m L JE11可保护He La细胞抵御10×IC50RT毒性,对小鼠进行肌肉注射JE11与RT,证明320μg/只JE11可在72 h内保护小鼠抵御2×LD50的RT毒性。4.利用生物信息学技术预测抗体结合力的研究本研究通过Discovery Studio软件对RT和JE11的分子模型进行对接,得到RT与JE11的复合物模型。由于结合界面的氨基酸大多集中在重链可变区,因此采用单点突变的策略,对于重链可变区CDR区或结合界面上的氨基酸向二十个天然氨基酸进行突变。通过软件组合、比较亲和力,最终设计出三株突变体进行下一步实验。通过ELISA方法比较JE11的三株突变体与JE11的亲和力区别,ELISA结果显示,JE11-5759的亲和力和稳定性均得到明显提高。综上,本研究通过筛选全人源噬菌体单链抗体库,制备了全人源抗蓖麻毒素单链抗体,并对单链抗体进行表达条件、纯化的工艺优化及生物学活性的研究,最后利用生物信息学技术预测抗体结合力,并提高了该抗体的稳定性与亲和力。研究制备的全人源抗蓖麻毒素单链抗体为蓖麻毒素检测、蓖麻毒素中毒的诊断或治疗奠定基础。