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病原感染会引起免疫系统改变,而炎症是常见的早期症状。不同病原引起的炎症反应程度不同,轻度炎症可促进机体清除病原,但不引起器官的炎性损伤,而重度炎症反应,会使免疫细胞发生过度应激反应。当病原侵袭宿主时,巨噬细胞不仅在宿主免疫反应中发挥着关键作用,还能调控炎症反应的平衡。巨噬细胞通常分成两种炎症极化表型:经典激活(M1)型和替代激活(M2)型。不同表型有不同的表面标志物,并通过分泌不同的细胞因子、趋化因子和酶,来更好的应对生理环境的变化。确定病原感染宿主时巨噬细胞的极化表型,对于病原致病机制研究和确定治疗策略十分重要。目前,由于缺少马巨噬细胞极化标志物对应的单克隆抗体,鉴定表型的方法仍比较单一。本研究旨在制备马巨噬细胞极化标志物CD80和CD163的单克隆抗体,为了获得马源CD80和CD163的基因序列,我们提取马外周血巨噬细胞RNA,以其为模板反转录并扩增目的片段。通过合成肽和重组表达,分别获得两种蛋白并将它们作为免疫原免疫小鼠。Western blot表明,这些抗体既能特异性识别真核表达的蛋白,也能与马内源性蛋白结合。利用荧光定量PCR技术检测CD80和CD163的mRNA水平,在M1型激活剂(LPS联合IFN-γ)刺激马巨噬细胞后,CD80和其他M1型巨噬细胞标记基因(TNF-α、IL-1β和IL-12)也出现上调;而M2型激活剂(IL-4或IL-10)刺激马巨噬细胞后,CD163与其他M2型巨噬细胞标记基因(TGF-β、IL-10和CD206)也不同程度上调,由此确定CD80和CD163可以作为马巨噬细胞极化标记物,且另外6种基因也可辅助证明马巨噬细胞极化表型。最终,利用流式细胞技术、Western blot及荧光定量PCR对马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi,S.Abortus equi)、马疱疹病毒Ⅰ型(Equine herpesvirus,EHV-1)、马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)和马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)感染后马巨噬细胞的极化表型进行鉴定,研究发现,在感染早期,S.Abortus equi、EHV-1和EAV能刺激巨噬细胞释放大量促炎性因子并极化为M1型。而EIAV促使巨噬细胞极化成M2型。综上所述,本研究确定了CD80和CD163以及其他6种基因可作为马巨噬细胞极化标记物。我们成功制备了马源CD80和CD163单克隆抗体,其可用于马巨噬细胞极化表型的鉴定。在此基础上,利用上述单克隆抗体对S.Abortus equi、EHV-1、EAV和EIAV刺激后马巨噬细胞极化进行了鉴定。本研究丰富了马巨噬细胞表型鉴定的方法,能够更好地了解它们在疾病发展中各自的作用,为进一步研究病原感染巨噬细胞引起疾病的机制提供了生物学工具。