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天然产物因往往具有新颖的骨架和独特的作用机制,成为抗肿瘤新药研发的重要途径。本研究在课题组前期工作的基础上,从大戟科大戟属植物猫眼草（Euphorbia lunulate Bge）中分离得到松香烷型二萜化合物ent-3a-formylabieta-8（14）,13（15）-dien-16,12β-olide(EFLDO,C21H28O4),在体内外进行抗肿瘤活性及其机制研究。本研究具体内容如下:1.选取9种不同器官来源的12株肿瘤细胞株对EFLDO抗肿瘤活性进行体外评价。2.以人肝癌HepG2细胞为研究对象,分别从增殖、细胞周期、凋亡等方面综合考察EFLDO在HepG2细胞上的生物学活性,初步探索其作用机制。3.考察EFLDO与人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL抑制肿瘤细胞活性是否具有协同效应,阐明EFLDO联合TRAIL诱导细胞凋亡的分子机制。4.考察EFLDO对HepG2细胞侵袭和迁移能力的影响,基于分子生物学研究对其作用机制进行研究。通过上述实验,得出以下研究结果:1.EFLDO对HCT-116、MCF-7、NCI-H460、K562、HeLa、MGC-803、EJ、CNE-2Z存在不同程度的的抑制作用。给药72 h后IC50值分别为27.31μM、19.74μM、46.72μM、83.36μM、10.30μM、24.09μM、26.48μM、30.23μM。针对肝癌细胞HepG2、Bel7402、QGY7701和Bel7402/Fu,EFLDO给药72 h后IC50分别为7.72μM、28.10μM、21.67μM和32.83μM。同时,在人正常细胞系HUVEC以及L02上,EFLDO给药72 h后IC50分别为40.32μM和65.46μM。2.在HepG2细胞上,6.25μM、12.5μM、25μM及50μM EFLDO给药24 h、48 h及72 h后表现出显著增殖抑制作用,且呈时间和浓度依赖性。Annexin V-PI双染结合流式细胞术检测显示,经过25μM、37.5μM、50μM和70μM EFLDO给药12 h、24 h、36 h和48 h后,HepG2细胞的凋亡率呈明显的时间、浓度依赖性增加。Hoechst 33342染色结果表明25μM、50μM、75μM EFLDO作用0、24、48、72h后,HepG2细胞出现浓染致密的颗粒状荧光,表现为细胞凋亡特征。JC-1线粒体膜电位实验表明EFLDO可破坏细胞线粒体膜电位进而诱导HepG2细胞凋亡。6.25μM、12.5μM、25μM及50μM EFLDO给药12 h,24 h,36 h及48 h后,HepG2细胞中活化的caspase3、8、9蛋白均有不同程度上调,同时Bcl-2和survivin蛋白下调,Bax上调,且均表现出时间和浓度依赖性。PI单染结合流式细胞术检测细胞周期结果表明,EFLDO可以诱导HepG2细胞G2/M期停滞,且这种作用具有时间和浓度依赖性。Western Blot检测发现,EFLDO可时间、浓度依赖性地下调周期相关蛋白Cyclin B和CDK1,同时显著下调p-AKT、AKT、p-ERK和ERK蛋白表达。在HepG2移植瘤模型中,EFLDO给药可剂量依赖地抑制移植瘤生长,10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg EFLDO肿瘤抑制率分别为24.9%、42.6%和57.8%。免疫组化结果表明EFLDO能剂量依赖地抑制Ki67蛋白表达。3.与单独使用EFLDO及单独使用TRAIL相比,3μM EFLDO联合25 ng/mL TRAIL对HepG2细胞增殖抑制作用明显提高。Annexin-V FITC/PI双染结合流式细胞术检测显示,3μM EFLDO联合25 ng/mL TRAIL可显著增加HepG2细胞凋亡。Western Blot检测显示,3μM EFLDO联合25 ng/mL TRAIL可显著增加caspase 3和caspase 8的蛋白表达。同时,Bax和BAD蛋白显著上调,Bcl-2蛋白显著下调;DR4和DR5的mRNA和蛋白质表达水平与对照组相比均明显增加。p53-siRNA HepG2细胞中,TRAIL联合EFLDO作用后,caspase 3活性明显上调,HepG2细胞凋亡增多。4.1μM、2μM和4μM EFLDO给药48 h能显著减少细胞划痕中划痕间距离。2μM、4μM及8μM EFLDO给药24 h后,HepG2在包被和未包被Matrigel胶的Transwell小室中的穿膜细胞数均明显减少。2μM、4μM及8μM EFLDO给药24 h后,HepG2细胞中MMP2和MMP9在蛋白和基因水平均显著下调。本研究在体外模型上对EFLDO抗肿瘤活性进行了评估,发现其具有广谱抗肿瘤效果,对肝癌细胞HepG2的生长有较强的抑制作用。阐明了EFLDO可通过下调cyclin B、CDK1蛋白,使细胞周期在G2/M期发生停滞;下调Bcl-2/Bax和survivin蛋白表达,激活caspase信号通路,诱发线粒体途径细胞凋亡;调节MMP2、MMP9减弱肿瘤细胞迁移;并增敏TRAIL诱导的依赖p53信号通路细胞凋亡。本研究成果有助于开发EFLDO联合TRAIL作为治疗肝癌新的手段,也为EFLDO临床应用治疗癌症提供现代科学依据。