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研究背景我国每年新生儿出生缺陷率为5.6%左右,出生缺陷的病因复杂,遗传因素和环境因素均可导致出生缺陷的发生。妊娠期微生物感染是环境因素主要种类之一,金黄色葡萄球菌(金葡菌,S.aureus)是细菌感染性疾病中最常见的病原菌之一,也是导致孕妇不良妊娠结局及胎儿发育异常的重要因素。葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)为金葡菌的重要致病物质之一,既是一种毒素性致病物质,也是超抗原家族中最常见、最重要的一种超抗原。导师课题组前期研究发现,妊娠期孕鼠给予SEB可明显影响子代鼠中枢及外周CD4/CD8T细胞的构成比例,但有关妊娠期孕鼠给予SEB对子代鼠T细胞起平衡调节作用的CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg细胞(以下统称“Treg细胞”)影响的研究,国内外尚无报道。本项目拟研究妊娠期孕鼠给予SEB对新生及成年子代鼠胸腺及外周血Treg细胞的影响,用流式细胞术检测子代鼠胸腺及外周血中Treg细胞的数量;用ELISA法检测外周血中IL-10和TGF-β的含量;用实时定量PCR和Western blot检测FoxP3的mRNA和蛋白水平。其结果将为探讨SEB与有关免疫性疾病的发生机理关系、提高人口健康和出生质量具有极其重要的价值。目的研究妊娠期孕鼠注射SEB对其子代鼠胸腺及外周血中Treg细胞的影响。方法1.建立妊娠期孕鼠模型及注射SEB成年雌雄SD大鼠(雌性约50只,雄性约20只)按1:1比例于18:00合笼,次日发现阴栓后即认为雌鼠已受孕,记为妊娠第一天(gestational day 1,GD1)。在GD16,孕鼠随机分为两组,实验组孕鼠通过尾静脉注射0.3ml 50μg/ml SEB,对照组给予同等体积的PBS,然后让孕鼠继续妊娠至孕期满,待自然分娩后,取一部分新生子代鼠进行相应的实验研究,另一部分让其继续生长至成年期进行相应的实验研究。2.实验分组2.1在新生子代鼠研究中,分为实验组和对照组。实验组为GD16给予SEB注射的孕鼠分娩得到的新生子代鼠,标记为“新生鼠SEB组”。对照组为给予同等体积PBS注射的孕鼠分娩得到的新生子代鼠,标记为“新生鼠PBS组”。2.2在成年子代鼠研究中,分为实验组和对照组。实验组为妊娠期注射SEB孕鼠所产的成年子代鼠,标记为“成年鼠SEB组”;对照组为妊娠期注射同等体积PBS孕鼠所产的成年子代鼠,标记为“成年鼠PBS组”。2.3在成年子代鼠再次应答的研究中,分为四组。妊娠期给予PBS注射的孕鼠所产的成年子代鼠,在成年期分别再次给予PBS或SEB注射,相应记为“PBS+PBS组”及“PBS+SEB组”。妊娠期给予SEB注射的孕鼠所产的成年子代鼠,在成年期分别再次给予PBS或SEB注射,相应记为“SEB+PBS组”及“SEB+SEB组”。3.妊娠期孕鼠注射SEB对新生子代鼠Treg细胞的影响研究3.1妊娠期孕鼠注射SEB对新生子代鼠胸腺和外周血Treg细胞数量的影响研究妊娠期孕鼠注射SEB,在新生子代鼠出生后第1、3、5天,取其胸腺制成单细胞悬液,并获取外周血,用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,用荧光标记的抗体(CD3-FITC,CD4-APC,CD25-PE,FoxP3-percy5.5)进行胞内外染色后,采用流式细胞仪检测其胸腺和外周血中Treg细胞的比例,并计算Treg细胞的绝对数量。3.2妊娠期孕鼠注射SEB对新生子代鼠第五天外周血中细胞因子的影响研究孕鼠于妊娠期注射SEB,待其自然分娩,在新生子代鼠出生后第5天断头获取其抗凝血液,离心得到血浆,通过ELISA法测定IL-10和TGF-β的含量。3.3妊娠期孕鼠注射SEB对新生子代鼠FoxP3蛋白及mRNA水平的影响研究获得新生子代鼠胸腺及外周血单个核细胞,抽提其总RNA并逆转录为cDNA,通过real-time PCR检测细胞中FoxP3的mRNA水平;提取样本中的总蛋白,采用western blot定量检测FoxP3蛋白表达水平。4.妊娠期孕鼠注射SEB对成年子代鼠Treg细胞的影响研究4.1妊娠期孕鼠注射SEB对成年子代鼠胸腺和外周血Treg细胞数量的影响研究妊娠期孕鼠注射SEB后,待其新生子代鼠生长至成年(3-5个月),取其胸腺制成单细胞悬液,并获取外周血,用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,用荧光抗体(CD3-FITC,CD4-APC,CD25-PE,FoxP3-percy5.5)染色后,流式细胞仪检测Treg细胞的比例,并计算Treg细胞的绝对数量。4.2妊娠期孕鼠注射SEB对成年子代鼠外周血中细胞因子的影响研究孕鼠于妊娠期注射SEB,待新生子代鼠生长至成年后,抽取腹主动脉血液并抗凝,离心获得血浆,通过ELISA法测定IL-10和TGF-β的含量。4.3妊娠期孕鼠注射SEB对成年子代鼠FoxP3蛋白及mRNA水平的影响研究获得成年子代鼠胸腺及外周血单个核细胞,抽提其总RNA并逆转录为cDNA,通过real-time PCR检测细胞中FoxP3的mRNA水平;提取样本中的总蛋白,采用western blot定量检测FoxP3蛋白表达水平。5.再次给予SEB对成年子代鼠Treg细胞的影响研究妊娠期给予SEB或PBS孕鼠的成年子代鼠,分别再次给予SEB或PBS尾静脉注射,5天后获取成年子代鼠的胸腺和外周血进行如下研究。5.1再次给予SEB对成年子代鼠胸腺和外周血中Treg细胞数量的影响研究淋巴细胞分离液分离胸腺及外周血单个核细胞,通过荧光标记的抗体(CD3-FITC,CD4-APC,CD25-PE,FoxP3-percy5.5)进行胞内外染色,采用流式细胞仪检测其Treg细胞的比例,并计算Treg细胞的绝对数量。5.2再次给予SEB对成年子代鼠外周血中细胞因子的影响研究抗凝的外周血离心后得到血浆,通过ELISA法测定成年子代鼠外周血中IL-10和TGF-β的含量。5.3再次给予SEB对成年子代鼠胸腺和外周血中FoxP3蛋白及mRNA水平的影响研究淋巴细胞分离液分离成年子代鼠胸腺及外周血获得单个核细胞,抽提其总RNA并逆转录为cDNA,通过real-time PCR检测该细胞中FoxP3的mRNA水平;通过提取样本中的总蛋白,采用western blot定量检测FoxP3蛋白表达水平。结果1.成功建立孕鼠模型合笼后次日发现阴栓即认为雌鼠已受孕。在GD16给予孕鼠尾静脉注射15μg SEB,然后让其继续妊娠至孕期满,待其自然分娩,则表明孕鼠模型建立成功,模型成功率70-80%。2.妊娠期孕鼠注射SEB对新生子代鼠Treg细胞的影响(1)妊娠期孕鼠注射SEB对出生后第1、3、5天新生子代鼠胸腺及外周血中Treg细胞的百分比并无影响,但明显增加新生子代鼠胸腺及外周血中Treg细胞的绝对数量。(2)妊娠期孕鼠注射SEB明显增加新生子代鼠第5天外周血中IL-10和TGF-β的含量。(3)妊娠期孕鼠注射SEB明显增加出生后第1、3、5天新生子代鼠胸腺及外周血中FoxP3的mRNA及蛋白水平。3.妊娠期孕鼠注射SEB对成年子代鼠Treg细胞的影响(1)妊娠期孕鼠注射SEB对成年子代鼠胸腺及外周血中Treg细胞的百分比并无影响,但明显增加成年子代鼠胸腺及外周血中Treg细胞的绝对数量。(2)妊娠期孕鼠注射SEB明显增加成年子代鼠外周血中IL-10和TGF-β的含量。(3)妊娠期孕鼠注射SEB明显增加成年子代鼠胸腺及外周血中FoxP3的mRNA及蛋白水平。4.再次给予SEB对妊娠期注射SEB孕鼠的成年子代鼠Treg细胞的影响(1)PBS+SEB组与PBS+PBS组比较,胸腺中Treg细胞的比例明显升高,而SEB+SEB组与PBS+SEB组比较明显降低。SEB+PBS组与PBS+PBS组比较、SEB+SEB组与PBS+SEB组比较,胸腺中Treg细胞绝对数明显升高,而PBS+SEB组与PBS+PBS组比较、SEB+SEB组与SEB+PBS组比较明显降低。PBS+SEB组与PBS+PBS组,SEB+PBS组与PBS+PBS组比较,外周血中Treg细胞的比例明显升高。SEB+PBS组与PBS+PBS组、PBS+SEB组与PBS+PBS组比较,外周血中Treg细胞绝对数明显升高,而SEB+SEB组与SEB+PBS组、SEB+SEB组与PBS+SEB组比较则降低。(2)SEB+PBS组、PBS+SEB组与PBS+PBS组比较外周血中IL-10和TGF-β的含量明显升高,而SEB+SEB组与PBS+SEB组、SEB+PBS组比较明显降低。(3)SEB+PBS组、PBS+SEB组与PBS+PBS组比较,胸腺和外周血中FoxP3的mRNA和蛋白水平明显升高,而SEB+SEB组与PBS+SEB组、SEB+PBS组比较明显降低。结论1.妊娠期孕鼠注射SEB可对其新生子代鼠中枢和外周的Treg细胞、转录因子FoxP3和细胞因子产生正向调节作用,使其升高。2.妊娠期孕鼠注射SEB对其成年子代鼠中枢和外周的Treg细胞、转录因子FoxP3和细胞因子产生正向调节作用,使其升高,且与新生子代鼠的变化趋势一致,表明妊娠期孕鼠注射SEB对子代鼠Treg细胞的影响可以从新生期保留至成年期,形成印迹效应。3.妊娠期孕鼠注射SEB可改变成年子代鼠中枢和外周Treg细胞对再次给予SEB的应答能力。